1、第6章 核酸测序技术 和基因突变技术,本章内容,核酸测序的发展及核酸测序技术 测序结果的分析 下一代测序技术 基因突变技术的目的 基因突变的方法,1 核酸测序技术的发展,1965年,Robert Holley历时7年测定了酵母丙氨酸转运tRNA序列(共77nt),沿用蛋白测序策略:断裂-各自测序-拼接； 1971年吴瑞(Wu Ray)等人测定了噬菌体cos位点12bp的序列:先将DNA转换成RNA再测序,吴还提出了DNA测序的引物延伸策略(Primer extension):引物在目标分子固定位点引发聚合，在不同位点终止，产生具有一端相同、长度不同的一群分子；后来的化学与酶法借鉴了这种思想；
2、1975年Fred Sanger等人提出了加减法(plusminus method),利用DNA聚合酶和放射标记引物合成长度不同的片断,经电泳及放射显影后后读出序列,Sanger测出了噬菌体x174序列(5386 bp)；,现代DNA测序技术,到1977年,产生了两种DNA测序的完善方法：Allan Maxam和Walter Gilbert提出的化学法和Sanger提出的双脱氧法； 这两种方法成为人工测序的主要方法； Sanger提出的双脱氧法已被用于测序仪，并在人类基因组测序中发挥了巨大威力。 2005年以后，非sanger原理的高通量测序技术出现（下一代测序技术）使测序的效率大大提高。,基
3、于Sanger技术的测序,下一代测序技术（Next generation sequencing technology）,步骤：待测DNA 片段末端标记（或5或3 )； 分成5 组,分别进行化学处理,使每组分别于某种或某类碱基处断裂,控制化学反应的程度,以确保每个DNA 分子平均只裂解一次,且断裂位置随机；然后每组样品在变性PAGE电泳中分离后读取DNA 序列； DNA 片段化学处理分两步， 对特定碱基（或特定类型碱基）进行化学修饰； 用特定试剂使修饰碱基从糖环上脱落，修饰处的5和3磷酸二酯键发生断裂； 缺点是：测序能力有限，每次反应只能测200-300个碱基，并且用到刺激性试剂； 应用：现主要
4、用于一些类似测序的操作中，如DNAase I足迹分析，以研究DNA与蛋白质的结合情况。,A Maxam和Gilbert法,B Sanger法(酶法、双脱氧法、链终止法),DNA聚合酶能够利用单链DNA作模板,消耗dNTP,合成DNA互补链； DNA聚合酶也能利用2,3-双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)作底物,掺入到寡核苷酸链的3末端；一旦掺入，DNA链合成的终止； 测序用的酶：起初为Klenow酶，后为改造的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶），现在也用Taq酶。,双脱氧终止法的步骤,分离待测核酸单链； 在4只试管中加入引物(可标记)、模板、4种dNTP和DNA聚合酶，并分别加入一种ddNTP； D
5、NA聚合酶催化引物5 3的延伸反应，32P掺入到新合成链中，当ddNTP掺入时，由于在3位置没有羟基，从而使链延伸终止，ddNTP在随机位置掺入，产生一系列不同长度的新的DNA链； 用聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物； 放射自显影，读出与模板链互补的链的序列。,测序模板的制备,从M13噬菌体分离到的ssDNA； 通过碱或热变性的质粒dsDNA； 通过碱或热变性的PCR dsDNA； 热循环测序中热变性的dsDNA； 如果模板中GC含量过高或有重复序列都会给测序带来麻烦。,测序的自动化,若每种ddNTP掺入后的DNA产物能够区分，则双脱氧法测序的四管反应可以合为一管，提高效率；
6、在自动测序中，人们使用能发出不同荧光的化学物质标记四种ddNTP，单管反应； 之后单泳道PAGE电泳或毛细管电泳 最后经氩离子激光器激光激发并用光系统记录； 扫描峰直接输到计算机中，由专用软件读序列； 实现从酶促反应到读序列的全部自动化； 每天可测定上百万碱基序列，正确率大于98;,Inside the sequencer,Capillary tubes,Sample tray goes here,Reagents,C 焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术,按这项测序技术的原理可分为：3酶系统和4酶系统； 目前4酶焦磷酸测序自动仪器可在市场上购到； 四酶焦磷酸测序需要：DNA Pol
7、ymerase、ATP Sulfurylase（ATP硫酸化酶）、Luciferase（荧光素酶）和Apyrase（腺苷三磷酸焦磷酸酶）； 底物： APS （adenosine 5 phosphosulfate，腺苷-5-磷酸硫酸酐）和Luciferin（荧光素）；,4酶焦磷酸测序中涉及的酶促反应,Luciferase（荧光素酶）,Pyrosequencing的原理,将测序引物和单链DNA模板结合，然后加入四种酶以及底物； 加入1种dNTP，若与模板的碱基配对，聚合酶催化其加到引物3 端，并释放1分子 PPi； ATP硫酸化酶催化PPi和APS生成ATP；荧光素酶消耗ATP催化荧光素成氧化荧光
8、素，产生可见光。光学系统测到检测峰，峰值的高低和延伸碱基数成正比； 体系中剩余的dNTP和残留的ATP在Apyrase的作用下降解，并生成磷酸（phosphate）; 加入另一种dNTP，使第24步重复进行，根据峰值图可读取DNA序列;,1,2,3,4,5,PyroMark MD,PyroMark ID,http:/ of Pyrosequencing,determination of difficult secondary DNA structures mutation detection cDNA analysis Resequencing of disease-associated ge
9、nes Microbial typing single-nucleotide polymorphism analysis,2 测序报告的分析,得到的DNA样品(可以为纯化的DNA、保存的菌种、PCR产物等)的测序一般委托公司完成，需要提供菌的培养基类型、载体的抗性、测序引物的名称或引物、电子邮件地址等信息； 测序结果中N值较多; 找不到PCR引物； 基因序列与标准序列为什么有差别，掐头去尾； 测序出现双峰或信号中断；,通用引物,各实验室通用（序列一致、名称一致）； 测序公司免费提供测序使用； 在常用的测序载体中MCS两侧会带一些通用引物的结合位点。,填写测序单： 写明样品类型、特性、编号、引物
10、名称以及联系方式,http:/ Genome Sequencing: Towards Personalized Medicine. Edited by Michal Janitz, 2008 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim,ISBN: 978-3-527-32090-5,下一代测序技术原理,片断化的DNA两端加接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列（polony）； 每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。 之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所
11、掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷贝和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。,下一代测序平台,3种广泛使用的商业化平台是Illumina的Genome Analyzer,罗氏454基因组测序仪以及AB Life Technologies 的SOLiD系统. 它们基本都是在20世纪90年代末被发明和开发出来, 在2005年前后商业化； Polonator G007是最近刚刚实现商业化的新设备, 该仪器最初由哈佛大学George Church 实验室开发, 现在由Dover Systems 公司制造。 Complete Genomics 公司最近推出了基于其专利技术的测序
12、服务平台。,Illumina的Genome Analyzer,1. 文库制备：将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。 2. 产生DNA簇：利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物 碱基互补被一端“固定”在芯片上。另外一端（5或 3）随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定” 住，形成“桥 (bridge)”。反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。DNA簇产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。,3. 测序：Genome Analyzer系统
13、应用了边合成边测序 （Sequencing By Synthesis）的原理。DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后， 将这些基团化学切割，恢复3端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。目前的配对末端读长可达到2100 bp，更长的读长导致错误率增高（如荧光标记的不完全切割）。,3 基因突变,在自然条件下生
14、物体的基因组DNA以一定的速率发生突变； 从这些突变中，人们可以了解有关基因如何活动； 但是自发的突变频率一般非常低； 一些理化因素由于能使DNA分子发生变化，大大提高了突变率； 以上的这些突变过程往往是在体内发生的，但突变部位对基因组DNA而言大多是随机的，对于某个要研究的序列而言，出现突变频率太低而且方向不定。,体外基因突变技术和目的,通过分子生物学技术，可以使DNA序列发生确定的、或者比较确定的突变； 发生突变的部位如果是调控区，则可以鉴定DNA元件，如果是编码区，则可以了解蛋白质的功能与其一个或几个氨基酸残基的关系； 在蛋白质、酶分子的结构域确定、酶与蛋白质工程中发挥重要作用； 帮助人
15、们在试管中模拟分子进化。,DNA突变的种类,一类是一个或几个碱基被其它碱基所代替，包括转换和颠换； 另一类是一个或几个碱基被删除(deletion)或插入(insertion)； 单个碱基的转换和颠换造成的密码子的改变，可能是沉默(silent)突变、或无义(non-sense)突变，或错义(mis-sense)突变； 碱基的插入或删除可能造成读码框(reading frame)的改变(frame-shift)。,体外基因突变的方法,引物延伸法(Primer Extension )制造突变 (Mutagenesis) 盒式突变技术（Cassette Mutagenesis） 基于PCR的突变技
16、术 其它技术,A 引物延伸法(Primer Extension ),先合成一段引物，这段引物含有要突变成的某种序列； 借助于DNA聚合酶在引物引导下，合成野生型DNA链的互补链； 筛选出“纯合的”突变DNA双链分子即可获得突变的基因或基因片段；,通过分子杂交法得到突变分子,是先把欲突变的基因克隆到(即重组到)M13载体上； 制备重组的M13噬菌体单链，用人工合成的引物引导合成互补链，并用T4连接酶连接成双链环状分子； 转化进大肠杆菌细胞后，借助于细菌的复制系统得到子代分子； 借助于杂交法从后代分子中筛选出纯合双链分子；,链选择的方法(Strand Selection),为了将突变链和野生链形成
17、的杂合分子中的野生型链选择性除去以提高效率可以采用硫代磷酸( Phosphorothioate)掺入法和dutung链选择法； 前者在用带突变的引物引导合成互补链时，使用的dNTP类似物(dNTP-S，磷酸基团的双键O被S取代的dNTP) ,之后用内切酶消化，造成野生链的大量缺刻(nick),用外切核酸酶III（exonuclease III）选择性除去野生型链； 后者是在制备M13单链时，使用dutung缺陷型宿主，得到的掺入dU碱基的M13单链，引物引导合成突变-野生杂合双链后导入到dut+ung+的宿主菌中，含dU的链发生核苷酸切除修复。,The dut gene encodes dUT
18、Pase whose function is to degrade dUTP within the cell. The dut mutation results in an elevated concentration of dUTP accumulating within the cell and results in incorporation of uracil (U) in place thymine (T) at some positions during DNA replication. The ung gene encodes uracil N-glycosylase, whic
19、h normally removes uracil from DNA.,B 盒式突变（Cassette Mutagenesis）,Cassette mutagenesis relies on the presence of two restriction enzyme recognition sites flanking the DNA that is to be mutated. The plasmid is cut with the enzymes and the large DNA fragment representing the majority of the plasmid is
20、purified from the smaller fragment.The linear plasmid DNA is then ligated to a synthetic double-stranded DNA produced through the annealing of two complementary oligonucleotides. The complementary oligonucleotides contain the desired mutation(s) and the required overhanging sequences for the ligatio
21、n to the restriction enzyme cleavage sites.,C 基于PCR的突变技术,PCR法不但可以在DNA片段的末端引入突变，如果设计得当，在任何位置引入突变都无问题； Two-step PCR即是其中一法； Mega primer法是最有效的PCR突变法之一；,Two-step PCR (overlap extension),Mega Primer法,该法使用3条引物和2轮 PCR 。一条是诱变引物，另外两条正向和反向引物分别结合在诱变引物位点的上游和下游。两侧的引物可以与克隆基因序列或载体序列互补。诱变引物的延伸可以朝向两条引物中较靠近的一条，以保持较短的大
22、引物长度。 在第一轮 PCR 中用诱变引物和靠近的内引物扩增出一条突变 DNA 片段。第二轮 PCR 采用上述扩增片段（大引物）与另一条内引物扩增出一条较长的 DNA 模板片段。 第一轮 PCR 获得的大引物需要经过PAGE纯化除去残留的引物。也可以使用正、反向内引物具有显著不同的解链温度。第一轮扩增反应使用的诱变引物和引物具有低 Tm值和低退火温度。第二轮 PCR 使用与第一轮 PCR 相同的反应管和第一轮反应产生的大引物，再加入高退火温度（一般为 72 ）的引物。,分子克隆实验指南(第三版,下，p1087),Mega primer法,新策略,在原始基因序列的任何位置引入突变制造突变体库，通
23、过噬菌体展示、细胞表面展示等方法筛选符合要求的突变分子； 是与分子文库技术的结合，是在实验室条件下进行的分子定向进化。,D QuikChange突变法,用一对重叠的、含有目标突变的引物对含有目的基因的质粒载体进行扩增； 如果亲代质粒源于dam+大肠杆菌，用Dpn I处理后，由于DpnI只作用被甲基化修饰的DNA链，因此野生型亲代链将被切成片断； 将质粒转化大肠杆菌，亲代链最终被降解，突变链的缺口被缝合并被复制；,DpnI只作用于被甲基化修饰的DNA链,一些通过定点突变进行的蛋白质工程实例,通过Infusion cloning引入突变,Infusion cloning借助于豆病毒（vaccini
24、a virus） DNA 聚合酶的 3 外切核酸酶（exonuclease），在载体与片段产生出长的5 单链突出链（15 nt），如果突出链是同源序列，则可以在载体与片段之间退火，转化进细菌后，能够修复成完好的重组分子。,1. Think about your final construct: Choose the vector you want to modify and envision your final, mutated construct (Figure 1; mutation shown in yellow). 2. Design your primers: Design inv
25、erse primers that overlap each other by 15 bp at their 5 ends and incorporate your desired deletion, substitution, or addition. Specific guidelines for mutagenesis primer design are described below. 3. Utilize the power of In-Fusion: Using an inverse PCR protocol, amplify the vector with your new pr
26、imers. Perform the In-Fusion reaction using the PCR product. The linear DNA will re-circularize at the site of the 15 bp overlap and will also contain your mutagenic changes. Transform a portion of the In-Fusion reaction into Stellar Competent Cells according to the In-Fusion HD Cloning Plus protocol. 4. Obtain your final construct: Recover your mutant from the Stellar cells the following day.,E 基因表达调控区的突变,Generation of Bidirectional Sets of Deletion Mutants by Digestion with BAL 31 Nuclease Generation of Sets of Nested Deletion Mutants with Exonuclease Ill,CRISPR/Cas9视频 https:/
