1、一、包装细胞 293T 细胞的培养一、293T 细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。3. 倒去细胞上清液，加入 D-Hanks 液洗去残留的培养基。4. 加入 0.25%的胰酶，消化 10-20s 后倒去。5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。6. 细胞计数。7.将细胞离心，1000rpm ，2min 。8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为 3106个/ml 。10. 第二天
2、将细胞放入液氮灌，并记录。二、293T 细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到 8090%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。2. 消化细胞，方法同上。3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3105 个/ml。4. 分到 10cm 培养皿中，10ml/皿。三、293T 细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过 50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。2. 打开水浴锅，设置温度为 40。3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在 12 min
3、 内使细胞溶液完全溶解。4. 将 1ml 细胞溶液加入 9 ml 完全培养基中并混匀后转入 10cm 培养皿。5. 放回 37、3%CO 2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入 10ml 新鲜培养基。二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为 WPRE 特异引物，序列如下5-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3 (forward primer),5-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3 (reverse primer) and5-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3 (probe)2
4、. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems， cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems， cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems， cat. no. 4316844)用于包装的 293T 细胞的培养用于包装的 293T 细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率 90%以上，细胞边缘清晰，
5、传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到 100%。慢病毒的包装1. 预先准备 3 个 T150 瓶的 293T 细胞，培养基为 DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。2. 将细胞分到 12 分到 12 个 T150 瓶中，每瓶的细胞密度是 8106 个。3. 第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为 30-40%，分布均匀。4. 转染前 1 小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入 20ml 的 Opti-MEM 培养基，将细胞送回培养箱。5. 取两支无菌的 50ml 离心管，其中一支中加入 252 g pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 载
6、体质粒，168 g pCD/NL-BH*DDD 包装质粒和 84 g pLTR-G 质粒，用 Opti-MEM 培养基补齐到 18ml。另一支中加入 500 l Trans-EZ溶液和 17.5 ml Opti-MEM 培养基，用电动移液器轻轻混匀。将 Trans-EZ 稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。关键步骤：推荐使用 Qiagen 质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。6. 室温孵育 20 分钟，使 DNA 和 Trans-EZ 充分结合形成转染复合体。7. 取 1 支 5ml 的移液管，将得到的 DNA-Trans-EZ 复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板 3ml。来回晃动培
7、养板，混匀后放回到 5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过 6 盘。8. 6 小时后，移去细胞上清，更换为 17ml 的 DMEM 完全培养基。9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近 60-80%。如果所转染质粒带有 GFP 荧光，那么这时候可以看到大于 95%的细胞都是带有荧光的。10. 将细胞送回培养箱继续培养 2 天（36-48 小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。11. 收集所有的上清，分装到 50ml 离心管中。12.4，500g 离心 10 分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。13. 总的上清约为 204 ml，用 2
8、50-ml 0.45 m PVDF 过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。慢病毒的浓缩与纯化方法一 超速离心沉淀法1. 取 6 个 Ultra-clear SW28 离心管，用 70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒 30 分钟。2. 每个 Ultra-clear SW28 离心管中加入约 32ml 的预先处理的病毒上清液。3. 取一支 10ml 的移液管，吸取 12 ml 20%的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出 4 ml。同样地，将剩下 8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下 3 管
9、进行同样处理。4. 用 PBS 调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过 0.1g。5. 按次序将所有 6 个离心管放入 Beckman SW28 超速离心转头中。7. 小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置 10 分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。8. 每管中加入 100ml 不含钙和镁的 PBS 洗下沉淀。9. 将 SW28 超速离心管插入到 50ml 锥底离心管中，盖上盖子。10.在 4溶解 2 小时，每隔 20 分钟轻轻震荡。11.4，500g 离心 1 分钟，使溶液集中于管底。12. 用 200l 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避
10、免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个 SW28 离心管中。13. 集中后的病毒悬液分装成 50l 每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在 -80 。方法二 PEG-8000 浓缩法PEG（聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，达到沉淀浓缩的目的。5X PEG8000+NaCl 配制 称取 NaCl 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在 200ml Milli-Q 纯水中；121 摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在 4。1. 使用 0.45m滤头过滤慢病毒上清液；
11、3. 每 2030min 混合一次，共进行 3-5 次；4. 4 度放置过夜；5. 4 度，4000 g，离心 20min；6. 吸弃上清，静置管子 12 分钟，吸走残余液体；7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8. 集中后的病毒悬液分装成 50 l每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml ，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为 “转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。第一天 细胞准备将生长状态良好的 293T 细胞消化计数后稀释至 1105/ml
12、，加入 96 孔板，100l/孔，为每个病毒准备 10 个孔。放入 37，5%CO 2 培养箱中培养。第二天 加病毒在 EP 管中做 10 倍梯度稀释，连续 10 个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备 10个 1.5ml EP 管，每管加入 90l培养液，往第一个管中加入 10l病毒原液，混匀后，吸取 10l加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（1010 -8）。吸取 96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。第三天 追加培养液在每个孔再加入 100l完全培养液，利于细胞的生长。第五天 观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为
13、 X 和 Y，则滴度（TU/ml ）=（X+Y*10）*1000/2/X 孔的病毒液的含量（l）。定量 PCR 法病毒感染 1 天前，取 6 孔板接种 HOS 细胞。每孔细胞为 5104 个。接种细胞 24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为 N。弃去其他培养板中的培养基，更换为含有 5g/ml polybrene 的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释 200 倍，也就是取 1l病毒加入到 199l的培养基中。在 3 个培养孔中分别加入 0.5l，5l 和 50l的稀释病毒。感染开始后 20 小时，除去培养上清，换为 500l含 DNaseI (Takara
14、 Mirus Bio，终浓度为 10 U/ml)的新鲜培养基。在 37消化 15 分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。然后换为 2ml 正常的培养基，继续培养 48 小时。用 0.5ml 0.25%胰酶-EDTA 溶液消化细胞，在 37放置 1 分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照 DNeasy 试剂盒的说明抽提基因组 DNA。每个样品管中加入200l洗脱液洗下 DNA。用 DNA 定量试剂盒定量（Bio-Rad ）。基因组 DNA 可以稳定保存在-20至少 2 个月。准备 PCR 所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管：2 TaqMan Master Mix 25 l n Forw
15、ard primer (100 pmol ml-1) 0.1l nReverse primer (100 pmol ml-1) 0.1l nProbe (100 pmol ml-1) 0.1l n H2O 19.7l n n = number of reactions. 例如：总反应数为 40，将 1ml 2 TaqMan Universal PCR Master Mix，4l forward primer，4l reverse primer，4l probe 和788l H2O 混和。震荡后放在冰上。为人基因组序列检测引物配总管：2 TaqMan Master Mix 25 l n 10RN
16、aseP primer/probe mix 2.5 l n H2O 17.5l n n = number of reactions. 例如：总反应数为 40，将 1ml 2 TaqMan Universal PCR Master Mix，100l 10RNaseP primer/probe mix 和 700l H2O 混和。震荡后放在冰上。在预冷的 96 孔 PCR 板上完成 PCR 体系建立。从总管中各取 45l加入到 A-D 各行的孔中，从总管中各取 45l加入到 E-G 各行的孔中。分别取 5l质粒标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 A-D 行中，每个样品重复 1 次。另留 1 个
17、孔加入 5l的水做为无模板对照（no-template control）。分别取 5l基因组标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 E-G 行中，每个样品重复 1次。另留 1 个孔加入 5l的水做为无模板对照（no-template control）。所使用定量 PCR 仪为 ABI PRISM 7000 定量系统。循环条件设定为： 50 2 分钟，95 10 分钟，然后是 95 15 秒，60 1 分钟的 40 个循环。数据分析：测得的 DNA 样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。滴度（integration units per ml，IU ml-1
18、）的计算公式如下：IU ml-1 = (C N D1000)/V其中： C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数 N = 感染时细胞的数目（约为 1105） D = 病毒载体的稀释倍数 V = 加入的稀释病毒的体积数 慢病毒的储存与稀释慢病毒的储存1. 病毒的运输采用干冰保温，收到病毒液后若几天内用于实验，可于 4保存（于一周内用完）。2. 若病毒量较大，需长期保存。则根据每次实验用量分装后放于-80 冰箱。一般病毒可以放于-80约 12 个月以上，但若超过 6 个月后使用，请重新检测病毒滴度。3. 避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。每次冻融会降低病毒滴度 10%。慢病毒的稀释需要稀释病毒时，将病
19、毒取出后置于冰上融解，用细胞培养用 D-Hanks、PBS 或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后 4保存，并尽快用于实验（于一周内用完）。慢病毒在细胞水平的使用什么是 MOI？“MOI”为”multiplicity of infection”的缩写，中文为“感染复数”或“复感染指数”，含义为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数（TU number /cell）。在实验中将某种细胞感染达到 80%时的 MOI 定义为这种细胞的MOI。MOI 与整合事件以及目的基因的表达相关。一定范围内，表达水平和 MOI 呈正相关。MOI 取决于多种因素，如细胞状态，目的基因的大小与性质
20、，细胞的感染效率等。所以，实验前需查阅相关文献，确定慢病毒对目的细胞的亲嗜性、MOI 以及在体（in vivo）注射所需病毒量。若无文献支持，可以通过预实验得到合适的 MOI。实际上，即使有文献支持，但由于所用细胞代数、细胞状态以及目的基因的差异，实际的 MOI和文献报道也会不同，所以要安排预实验以确定所需 MOI 以及病毒对细胞生长的影响。目的细胞感染预实验及实验体系的放大实验目的：确定细胞感染所需的 MOI，以及是否需要添加感染增强剂 Polybrene。实验材料：96 孔板，1.5ml EP 管，长势良好的目的细胞一瓶，已知滴度的慢病毒溶液，Polybrene （10mg/ml ），目的
21、细胞培养基等。第一天：细胞准备将长势良好的目的细胞接种到 96 板，消化好细胞（悬浮细胞不需要消化，直接离心收集细胞后加新鲜培养基重悬即可）后把浓度调为 31045104 个/ml，按 90l/孔加入。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于 3050%之间。第二天：病毒感染感染实验分两组，一组直接添加病毒液，一组同时添加 Polybrene。病毒稀释方法同病毒滴度测定时方法，10 倍倍比稀释，共三个稀释度，MOI 值依次为 100，10 和1（细胞经过一天的生长数量约为 1104 个/ 孔，对应的病毒数量为1106TU、110 5TU 和 1104
22、TU）。每个 MOI 值加两个孔，取出一组加入感染增强剂，比例为 1：2000 ，终浓度为 5g/ml。第二天：换液感染实验同一天，8-12 小时后，弃去上清液，更换为新鲜培养基，100l/孔。第五天：观察荧光表达情况在倒置荧光显微镜下观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。对于生长缓慢的细胞，可以适当推迟观察的时间，中途可以传代和换液，以保持细胞良好的生长状态。通过细胞感染的效果，确认目的细胞的感染 MOI 以及是否需要添加 Polybrene。对于因目的基因较大，载体无法携带标志基因的，可以通过定量 PCR 来检测目的基因的表达来评估感染效率。实验体系的放大正式实验时，由于细胞数量较大，所
23、需的病毒用量也需相应增大。放大的原则是保持细胞的密度不变，将培养基体积，病毒量按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大。即使这样，正式实验时由于体系的改变，加上预实验的 MOI 值设置跨度较大，可进行对MOI 的再次优化。 MOI 的设置值为预实验最佳值 0.5 倍，1 倍和 1.5 倍或自己设置合理的数值。表 1.病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考值单孔底面积（cm2） 正常培养体积（l ） 感染时体积（l ） MOI=1 病毒量（TU） MOI=10 病毒量（TU） MOI=100 病毒量（TU96 孔板 0.3 100 100 1104 1104 110448 孔板 0.6 200 200 2104 2105 210624 孔 1.9 500 500 6104 6105 6106板12 孔板 3.8 1000 500 2105 6106 61076 孔板 9.5 2000 1000 2105 2106 2107T25瓶 25 5000 2500 5105 5106 5107*表中可培养板底参数数值为 CORNING 公司产品参数。*对于孔面积较小的培养板，由于溶液张力的关系，培养基体积太少会导致病毒的分布不均与，所以不做减半处理。
