1、其次 , 采用一种含有拯救 rAAV 基因组的细胞株 ,又提高了包装效率 5 倍 9 。 M am ounas 等报道运用A d52多聚赖氨酸 2转铁蛋白 2DNA 2A d8 复合物感染H eL a 细胞 , 可使转导效率提高近 245 倍 10 。L ebkow sk i 等将 AAV 的 rep 和 cap 基因转染入293 细胞 , 建立了 rAAV 包装细胞系 , 也增加了病毒的滴度。纯化 AAV 病毒的传统方法是加热失活法和平衡密度梯度离心法。为了获得高滴度的 rAAV 载体用于临床实验 , Fan 等用增加 rep 2cap 质粒拷贝数来增加产量 , 但需要仔细调节 R ep 7
2、8 68 的水平 11 。H erm en s 用 iodixano l 密度梯度离心法取代 C scl法 , 缩短了离心时间 , 获得了高浓度的 rAAV , 减少了 C scl 对病毒的毒性作用 12 。对于 AAV 22 而言 ,由于存在细胞表面受体 , 所以能用亲和层析法纯化 ,避免了 C scl 和帮助者病毒的污染。这些细胞表面受体包括硫酸乙酰酣素糖蛋白受体、联合辅助受体、AV B5 整合素受体和人 FGF 受体 13 。5 rAAV 载体目的基因的表达基因治疗能否成功的关键是靶基因能在靶细胞内高效、稳定、足量、长期的表达。已有研究表明rAAV 能够在动物体内超过 18 个月的表达。
3、除了采用更强的启动子和增强子来取代常用的 CM V、SV 40 启动子之外 , 缺氧 ( 0. 01%O 2 ) 14 、紫外线 15 、羟基脲、 perfluo rochem ical (PFC) liqu ids 16 、细胞因子、肿瘤坏死因子 A 17 等也可提高目的基因的表达。综上所述 , AAV 作为载体有许多优点 : 它是一种非病原微生物 , 与已知的人类疾病无关 ; 它既能感染分裂细胞又能感染非分裂细胞 ; 它的内源性弱启动子对外源基因的调控无明显的干扰作用 ;且启动的方向不指向宿主细胞 DNA , 因此通过插入病毒启动子而激活细胞原癌基因的可能性极小 ; 其基因组结构极为稳定
4、, 有利商业开发 ; 可以口服给药 , 使给药方式更加方便 18 。尽管 AAV 的一些生物学特性尚待阐明 , AAV 载体在体内能否定向整合尚待明确 , 但现有资料使人们有理由相信 AAV载体将是未来基因转移中最有希望的新一代病毒载体之一。参 考 文 献1 Berns K I, L inden RM. B ioessays, 1995; 17: 2372 Sanlioglu S et al. H um an Gene T her, 1999; 10: 5913 Sam ulsk i RJ et al. EM BO J , 1991; 10: 39414 Balague C et al. J
5、V iro l, 1997; 71: 32995 T ang R S. B ioessays, 1994; 16: 7856 Ko tin RM. H um an Gene T her, 1994; 5: 7937 KearnsW G et al. Gene T her, 1996; 3: 7488 A lexander IE et al. J V iro l, 1994; 68: 82829 F lo tte TR et al. Gene T herapy, 1995; 2: 2910 M ammounasM et al. Gene T herapy, 1995; 2: 42911 Fan
6、PD , Dong JY. H um Gene T her, 1997; 8: 8712 H erm ensW T et al. H um Gene T her, 1999; 10: 188513 Zo lo tukh in S. Gene T her, 1999; 6: 97314 R uan H et al. N eop lasia, 2001; 3 (3): 25515 Kanazaw a T et al. Cancer Gene T her, 2001; 8 (2): 9916 W eiss DJ et al. M o l T her, 2000; 2 (6): 62417 N ath
7、w aniA C et al. Gene T her, 2000; 7 (3): 18318 M atthew JD et al. N ature M edicine, 1998; 4 (10):1131(2002201216 收稿 )慢病毒载体构建及结构优化李振宇综述 徐开林 潘秀英审阅徐州医学院附属医院血液科 (徐州 , 221002)摘要 慢病毒载体目前是基因治疗中研究较多的载体 , 与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较 , 它有感染非分裂期细胞及容纳外源性目的基因片段大等优点。对其结构的优化主要集中在提高生物安全性、提高转基因表达、转基因表达的调控及载体靶向性等方面。本文介绍了慢
8、病毒载体构建及结构优化方面的研究进展作一综述。关键词 慢病毒载体 ; 载体构建 ; 结构优化目前基因治疗中目的基因的转移工具多采用病毒载体 , 其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为常用。由于逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞 , 容纳外源基因的 DNA 片段长度不超过 8 kb; 腺病毒013 国外医学分子生物学分册 2002 年第 24 卷第 5 期载体感染细胞时 , 病毒 DNA 游离在细胞核内 , 并不整合到染色体上 , 在体内不能实现稳定的长期表达 ,且反复应用容易引起免疫反应。以人类免疫缺陷病毒 21 (H IV 21)来源的慢病毒载体越来越受到人们的重视 1 。研究发现慢病毒载体最大
9、的特点是可以感染非分裂期细胞 , 人们已成功地应用慢病毒载体感染了神经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞、视网膜色素上皮细胞、气道上皮细胞等。此外 ,慢病毒载体容纳外源性目的基因的片段大 , 可以在体内较长期的表达 , 免疫反应小 , 安全性较好。近来 ,慢病毒载体的研究进展迅速 , 但欲应用于临床尚需对其进一步加以改造 , 以进一步提高生物安全性、提高目的基因的表达及调控目的基因的表达。1 慢病毒载体的构建111 构建原理 2 慢病毒属于逆转录病毒科 , 但其基因组结构复杂 , 除 gag、 po l 和 env 这 3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外 , 还包括 4 个辅助基
10、因 , vif、 vp r、nef、 vpu 和 2 个调节基因 tat 和 rev 3 。 H IV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒 , 第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将 H IV 21 基因组中的顺式作用元件 (如包装信号、长末端重复序列 )和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分 : 包装成分由 H IV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建 , 能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白 ; 载体成分与包装成分互补 , 含有包装、逆转录和整合所需的 H IV 21 顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的
11、多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒 (RCV ) 的可能性 , 将包装成分的 5L TR 换成巨细胞病毒 (CM V ) 立即早期启动子 , 3L TR 换成 SV 40 po lyA 位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上 , 即一个表达 gag 和 po l、另一个表达 env。根据这个原理 ,N aldin i 和 Kafri 等构建了三质粒表达系统 1, 4 。112 三质粒表达系统三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中包装质粒在 CM V 启动子的控制下 , 表达 H IV 21 复制所需的全部反式激活蛋白 , 但不产生病
12、毒包膜蛋白及辅助蛋白 vpu; 包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒 G 蛋白 (V SV 2G) , 应用V SV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围 , 而且增加了载体的稳定性 , 允许通过高速离心对载体进行浓缩 , 提高了滴度 ; 转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列 , 还保留350 bp 的 gag 和 RR E, 并在其中插入目的基因或标志基因 (绿色荧光蛋白 GFP)。将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少 , 减少载体重组过程中产生 RCV 的可能性。通过三质粒共转染 293T 细胞 , 超速离心后病毒滴度可达 109IU m l。
13、113 四质粒表达系统为了减少 H IV 21 包装结构的序列同源性 , 进一步减少重组成 RCV 的可能性 , D u ll 5 等人将辅助基因去除。但由于 gag2po l 的转运需要 rev, 因此 , 在上述的三质粒系统的基础上 , 构建成四质粒表达系统 ,该系统加上含 rev 的质粒减少了产生 RCV 的可能性 , 而且对非分裂期细胞转导效率无影响。2 慢病毒载体结构的优化211 提高载体的生物安全性2. 1. 1 自身失活慢病毒载体 (S IN ) S IN 载体的构建是将载体 3, 端长末端重复序列 (L TR ) 中的 U 3区增强子和启动子序列去除。 U 32L TR 是前病
14、毒DNA 两端 L TR 中 U 3 的模板 , 在逆转录过程中 , 3L TR 中的缺失被传递到子代载体的 5L TR 中 , 所形成的载体缺乏 H IV 21 的增强子和启动子序列 , 即使在所有病毒蛋白都存在的情况下也不能转录RNA , 产生了一个灭活的前病毒 , 但其中的外源启动子仍然有活性 , 能进行基因转录与表达。这种方式主要用来消除病毒 L TR 中的启动子 增强子序列对病毒载体中外源启动子指导转录的干扰作用以及消除可能的由 3L TR 启动子指导的下游基因组中原癌基因的激活与转录作用 , 一定程度上提高了载体的安全性。其缺点是所产生的重组病毒滴度低 , 但Xu 6 应用 T e
15、t2反应元件 (TR E) 替代载体的 U 3 转录调控元件 , 使表达 T et 调控反式激活子 (tTA ) 的细胞可以产生较高滴度的病毒载体 , 而不表达 tTA的细胞则产量很低 , 同时可以在体外对 GFP 或目的基因的表达加以调控。由此所产生的慢病毒载体可以高效感染大鼠的神经细胞。2. 1. 2 包装系统的改造 Zufferey 7 等将包装结构中的辅助基因 vif、 vp r、 nef、 vpu 和调节基因 tat 去除 , 结果发现其保留了转导静止期细胞及单核细胞起源的巨噬细胞的能力 , 而且能在体内转导神经元细胞。应用这种最小的包装结构可在提高载体安全性的同时不影响其感染非分裂
16、期细胞的特性 , 分析原因可能是在产生病毒颗粒的过程中 , 任何可能有113 国外医学分子生物学分册 2002 年第 24 卷第 5 期复制能力的病毒载体都缺乏这些辅助蛋白和 H IV 21的致病特征。W u 8 等将 gag gag2po l 表达框分成两个部分 ,即 gag gag 蛋白酶框和 po l 表达框 , 将 H IV 21 的 po l和 vp r 融合使 po l 基因产物 (逆转录酶和整合酶 ) 能通过 vp r 与 P6 的相互作用而有效地掺合到载体颗粒中去。并进一步证实此系统完全阻止了载体将功能性 gag2po l 基因组传递到靶细胞中 , 而 gag2po l 结构对
17、逆转录病毒 DNA 的激活和 RCV 的产生是绝对需要的。因此 , 有可能将慢病毒载体系统分成 5 个组成部分 , 即 gag2蛋白酶、 vp r2po l、 rev、 V SV 2G 包膜蛋白和载体表达框 , 以期进一步减少产生 RCV 的可能性。在 H IV 21 gag2po l 表达质粒和 H IV 21 载体之间有两个同源性区域 : 包装信号延伸到 gag 基因中 , H IV 21 载体中包含 gag 序列 ; 载体 RNA 和gag2po l RNA 从核转至胞浆都要依赖 rev , 载体和gag2po l 表达质粒中都含有 rev 反应元件 (RR E )。Ko tsopou
18、lou 9 等通过对包装结构内 gag2po l 密码子进行优化 , 减小了和转移载体的序列同源性 , 因此减小了载体和包装结构重组的可能性。这种优化的包装结构可以在不依赖 rev 的情况下允许 gag2po l基因的高效表达 , 这就允许从包装结构中去除 rev和 RR E 序列 , 从而进一步减少载体和包装结构重组的可能性。 Pandya 10 采用非人类慢病毒为基础的载体 , 去除了其中的 rev 和 RR E 序列 , 结果引起转导能力的下降 , 之后引入脾坏死病毒的 5L TR 到包装质粒中 , 能完全恢复载体的滴度。而 M au tino 11 等应用 M PM V 或 SRV 2
19、1 基本运输元件 (CT E) 来替代 rev RR E 缺失的 m RNA 运输机制 , 同样可以保留感染非分裂期细胞的特性。2. 1. 3 非人类慢病毒载体的研制 非人类慢病毒载体的发展正受到人们的重视 , 其中包括猴免疫缺陷病毒 (S IV )、猫免疫缺陷病毒 (F IV )、牛免疫缺陷病毒 (B IV )、马感染性贫血病毒 (E IAV ) 等。这些病毒对人无致病性 , 在人类细胞中不会复制。可以高效转导分裂期及静止期细胞。但是 S IV 和 F IV 的 RNA可与 H IV 21 颗粒交叉包装产生 RCV , 这就在人畜之间产生了新的有复制能力的病毒的可能性。而且 ,Hofm an
20、n 12 等研究发现在非人类慢病毒载体转导人细胞的过程中 , 可能存在转导效率的障碍。而且人是 H IV 21 的天然宿主 , 在人类的临床实践中应用H IV 21 要比应用动物病毒所获得的期望值要高。212 提高转基因的表达2. 2. 1 L TR 的改造 Gao 13 等构建了一种杂合的慢病毒载体 , 其中 H IV 2L TR 中的 U 3 区被鼠干细胞病毒 (M SCV ) 的 U 3 区替代。之后用这种杂合的载体转导人脐血 CD 34+ 细胞 , 再将其植入联合免疫缺陷小鼠体内 , 在移植后 15 周时可以在小鼠的淋系、髓系和红系细胞中观察到高水平的标志基因 GFP的表达。 Cho
21、i 14 等发现在内部启动子 CM V 作用下 ,起源于 H IV 21 的载体在人 CD 34+ 造血细胞中转基因表达比起源于鼠白血病病毒 (M LV ) 的 M SCV 载体低 100 1000 倍。通过用劳斯肉瘤病毒或 M SCV 的L TR 来替代 CM V 启动子 , 基因表达有中度的提高。而当用 H IV M SCV 杂合的 L TR 代替 H IV 的L TR 且去除 CM V 启动子 增强子 , 观察到其不仅仍能转导非分裂期细胞 , 而且可以使 GFP 的表达较原先提高 10 100 倍。2. 2. 2 内部启动子的更换 目前常用的内部启动子为 CM V , 通过研究不同启动子
22、驱动下的转基因或标志基因在不同靶细胞中的表达发现 , 延长因子 12A(EF12A)是作用最强的内部启动子 15 。将磷酸甘油酸激酶 (PGK) 与 CM V 启动子比较时 , 得出的结果不一致。在纹状体细胞中 , PGK 的效率高于CM V 16 ; 而在 293T 细胞和纤维肉瘤 H T 1080 细胞中 , CM V 驱动 GFP 的表达率更高 17 。2. 2. 3 中央 DNA 侧翼序列的作用 在 H IV 21 基因组中 , 由中央多聚嘌呤序列 (cPPT ) 和中央终止序列(CT S)顺式控制的中心链替代导致了在 H IV 21 线性 DNA 分子中心一段 99 个核苷酸序列的重
23、叠 , 即中央 DNA 侧翼序列 (cen tral DNA flap ) , 它可促进H IV 21 基因组转入被感染的细胞核内。将此序列插入慢病毒载体可以促进对 CD 34+ 造血干细胞的转导 18, 19 。 Park 20 等还发现整合了 cPPT 的载体能在体外增加转导效率 , 在体内能增加对非细胞周期肝细胞的转导效率。2. 2. 4 内部核糖体进入位点 ( IR ES) 的作用 IR ES为细小 RNA 病毒 5非翻译区的引导序列 , 所引导的 RNA 直接进入核糖体而进行帽非依赖性翻译 ,文献 21 报道有一定的提高目的基因表达水平的作用。有人在内部启动子之前插入 IR ES,
24、或直接以IR ES 替代内部启动子 , 而前者似乎更能提高目的基因的表达。2. 2. 5 CD 2 的位点控制区 (L CR ) L CR 序列与开放性染色体结构域的建立有关。 Indracco lo 22 等用慢病毒载体转导 T 细胞时 , 将 CD 2 中的 L CR 插入其中 , 发现完整的 L CR (约 2. 1 kb) 可以提高标志基因 GFP 的表达水平 , 而截断的 L CR (约 1. 0 kb) 不能提高 GFP 的表达水平。213 国外医学分子生物学分册 2002 年第 24 卷第 5 期213 目的基因表达的调控Kafri 23 等构建了一个可诱导的慢病毒载体系统 ,
25、其中包含完整的四环素调控系统。在此系统中 ,GFP 的表达和四环素反式激活子分别在可诱导的四环素启动子和 CM V 启动子控制下 , 在有效应底物强力霉素存在时 , 体外转导 293T 细胞导致低水平的 GFP 的表达 ; 去除强力霉素后 , GFP 的表达提高 500 倍。 GFP m RNA 转录在加药 24 h 内达到最大抑制。转导大鼠脑组织之后 , 在终末分化神经元中可见强力霉素调控的 GFP 的表达 , 通过撤去或加入大鼠饮水中的强力霉素 , 可以在体内观察到 GFP 的表达或抑制。但在实验中仍可观察到不被强力霉素抑制的低水平的 GFP 表达 , 把四环素调控启动子插入载体的 U 3
26、 区 , 可以明显减少非控制性的 GFP 的表达 , 同时也降低了基因表达的最大水平。214 靶向性问题基因治疗中将治疗性目的基因转入特定的靶细胞并在该细胞中得到较高的表达即为基因表达的靶向性。常通过两种途径构建靶向性载体 : 将病毒颗粒与某一靶向分子或特异性抗体结合 ; 通过改变病毒包膜蛋白的结构 , 使其对细胞的亲嗜性发生变化。 Peng 24 等应用带有配体 EGF 多肽的载体在EGF 受体阴性细胞中有感染性 , 而在富含 EGF 受体的细胞中 , 则被灭活 , 称为反向靶向性。将 EGF 载体注入体内后发现在脾脏有虫荧光素酶表达 , 而在富含 EGF 受体的肝脏则低表达 , 预先应用可
27、溶性的EGF 来处理动物则在肝脏有高表达。 Yu 25 等采用前列腺特异性抗原启动子 (PSA ) 编码 GFP 和白喉毒素 A (D TA ) , 在前列腺细胞中可以特异性的表达 , 而且具有组织特异性的 D TA 蛋白的表达可以根除培养的 LN CaP 前列腺癌细胞。提示 PSA 载体对前列腺癌的靶向性。 M azarak is 26 等利用狂犬病病毒对神经系统的亲嗜性及可以进行逆向轴突转运的特性构建了用狂犬病病毒包膜糖蛋白假构型的慢病毒载体。通过直接向中枢神经系统注射和经外周途径注射 , 在中枢神经系统中均有标志基因的表达 ,而作为对照的 V SV 2G 假构型载体则无表达。提示采用改变
28、包膜蛋白的方法亦有可能实现载体的靶向性。尽管慢病毒载体的研究取得了很大的进展 , 但欲应用于临床尚有距离。如何通过对慢病毒载体的优化获得简便高效的病毒载体包装系统、可调控表达外源基因的病毒载体、靶向性载体及无病毒基因的病毒载体应该是今后努力的目标。相信对慢病毒载体的优化必将能为基因治疗开辟一个新的研究方向。参 考 文 献1 N aldiniL et al. Science, 1996; 272: 2632 Paro lin C et al. J M o lM ed, 1995; 73: 2793 F rankel AD et al. A nnu R ev B iochem , 1998; 67
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