1、 茵陈水溶性提取物体外抗巨细胞病毒效应的实验研究作者：王涛 刘修恒 祝恒成 陈志远 王向阳 【关键词】 茵陈；,抗病毒作用；,巨细胞病毒,摘要： 目的：探讨茵陈水溶性提取物溶液体外抗人巨细胞病毒(HCMV AD169)的效应。方法：采用细胞病变（CPE）抑制法观察茵陈水溶性提取物溶液对 HCMV AD169 毒株的抑制作用，使用MTT 比色法检测细胞的损伤程度，并利用吸光度（A）值评价茵陈水溶性提取物溶液的抗 HCMV 的效应。结果：茵陈水溶性提取物溶液半数中毒浓度(TC50)为 904.49 mgL-1 ，半数有效浓度(IC50)为 195.11 mgL-1mgL-1 ，治疗指数(TI)为4
2、.64 。茵陈水溶性提取物溶液具有抗 HCMV 的作用，且其作用随药物浓度的增高而增强。结论：体外实验证实，茵陈水溶性提取物是理想的抗 HCMV 中药。关键词： 茵陈； 抗病毒作用； 巨细胞病毒 巨细胞病毒（cytomegalovirus）是一种疱疹病毒科 属的双螺旋 DNA 病毒，在自然界广泛存在。正常人中 CMV 的潜伏感染率很高,血清学检查阳性率达 40%90%。普通人群感染后并不表现出症状,但在免疫缺陷或免疫抑制人群中却有极强的致病性, 肾移植后有症状的临床感染发病率是 20%60%,如果没有有效治疗,死亡率可高达 90%。在器官移植术后,尤其在使用免疫抑制剂的情况下,受体感染 CMV
3、 的机率更高1，甚至引起严重的 CMV 疾病。CMV 病治疗目前国内外都以更昔洛韦作为首选2,而目前常用的更昔洛韦等几种西药都存在毒副作用大、价位高、长时间使用耐药等缺点,临床观察表明在更昔洛韦耐药病人中易产生严重的并发症, 包括异体移植物的丧失、持久的视力损害等的发生率高达 80%3。而传统的中药制剂毒副作用小,价格低廉,服用方便，同时还有其他如抗菌、提高免疫力等效能。本研究所采用 CPE 和 MTT 方法观察并测定茵陈水溶性提取物溶液对 HCMV AD169 毒株液的抗病毒效用，为发现有效药物应用于临床防治巨细胞病毒感染提供实验依据。1 材料与方法11 材料111 人胚肺成纤维细胞(HEL
4、) 由山东省医学科学院基础研究所微生物研究室提供。实验所用为 413 代细胞。细胞生长液为RPMI1640 溶液加 10 %新生小牛血清,200 kUL-1 青霉素,200kUL-1 链霉素。细胞维持液为 RPMI1640 溶液加 2%新生小牛血清,所加抗生素同生长液。112 病毒 HCMVAD169 由山东医学科学院基础研究所微生物研究室提供,按常规增殖至实验需求量,测定半数组织培养感染数量TCID50 = 10-3.71。113 药物 注射用更昔洛韦(GCV)购于广东阳江制药有限公司, 批号：国药准字 H20033717,粉剂,每支 250 mg。将 GCV 溶于注射用水中,配制成 50
5、g/L 浓度,临用时用维持液配成不同浓度的溶液。茵陈水溶性提取物由北京师范大学资源学院资源药物工程研究中心提供，临用时用维持液配成不同浓度的溶液。114 主要试剂 MTT3(4 ,6 二甲基噻唑 2xl )2 ,5 乙苯基四唑溴盐、新生小牛血清、胰蛋白酶、Hank 氏液、HEPES 及二甲基亚砜(DMSO)均购自北京鼎国生物技术公司; RPMI1640 粉剂购自GIBCO。115 主要仪器设备 超级酶标测试仪购自美国,型号规格 550;二氧化碳培养箱购自美国，型号规格 Nu1700E。 12 方法121 病毒感染性滴度的测定 取经 24 小时培养后生长良好的HEL 细胞,加入 96 孔板中，每
6、孔 100mL(约 1.5105/孔), 将培养板置于 5%CO2 培养箱中,37 培养 18 小时,待细胞长成单层,将病毒原液以 10 倍递次稀释法4稀释成 9 种不同浓度 (10-1 ,10-2 ,10-3 ,10-4 ,10-5,10-6 ,10-7,10-8,10-9),每个稀释度设 8 个孔,将 9 种不同浓度的病毒液分别接种到长成单层 HEL 细胞的 96 孔板,每孔 25L,置于 5 % CO2 恒温培养箱内, 37吸附 1h 后,弃上清,以 Hank 氏液洗 3 次,加维持液 0.1 mL/孔,同时设细胞对照孔 8 孔,置 37 ,5 % CO2 培养箱培养,每日检查病毒生长情
7、况,在光学倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化并记录特征性细胞病变(CPE) 的孔数,12d 后记录结果。用ReedMuench 法5计算病毒的半数感染量(TCID50) 。ReedMuench 法计算公式： TCID50=10-（H R ）/（HL ）+E注：R 为计算的死亡率，H 为略高于 50%的死亡率，L 为略低于 50%的死亡率，E 为对应 H 死亡率的负指数。122 药物细胞毒性试验 取生长良好的 HEL 细胞,将细胞加入96 孔板,每孔 100L(约 1.5105/孔),待细胞长成单层后,同步化 24h,用未含抗生素的维持液将 GCV(药物对照组) 稀释成 200, 100, 50
8、, 25, 12.5, 6.25，3.2mgL-1 等 7 个浓度; 将茵陈水溶性提取物溶液亦稀释成 2000，1000，500，250，125，63，32mg.L-1 等 7 个浓度,将各浓度药物以每孔 200l 加入培养板,每个浓度设 4 孔做实验孔,同时设正常细胞对照组各 4 孔。细胞 MTT 比色法：以 CPE 法观察记录药物对 HEL 细胞的毒性结果后，每孔加入 MTT 染液20L（5mg/ml） ,置 5 % CO2 培养箱中，37 培养 4h ,可见细胞内形成甲赘结晶,弃染色液, 每孔加入 DMSO 150L ,振荡 10 min ,直至紫蓝色沉淀(甲赘) 充分溶解后,在超级酶标
9、仪 490 nm 波长处测吸光度(A) 值,计算各药物浓度时 TC50 及细胞的存活率。试验重复 3 次，取 3 次平均值作为试验结果。123 药物体外对病毒增殖的抑制作用 取生长良好的 HEL ,以每孔 100L ( 约 9.5 104 个细胞/ 孔) 的细胞悬液加入 96 孔板, 5% CO2 培养箱中 37 培养 24h ,细胞长成单层,同步化 24h 后以每孔约100 TCID50 攻击量攻击细胞,于 5% CO2 培养箱中, 37 吸附 1h,弃上清;将药液以低于 IC50 作 8 个稀释浓度分别加入细胞孔中,每孔150 L ,每一稀释度设 8 孔,同时设立细胞对照组、病毒对照组;
10、更换维持液隔天 1 次;在 5% CO2 培养箱中, 37 培养约 8 d ,待病毒对照组细胞病变达到 70%80% 时,每孔加入 MTT20L ,继续培养 4h ,吸弃上清,每孔加入 DMSO150L ,振荡 10 min ,在超级酶标仪 490 nm 波长下测吸光度(A) 值, 按下列公式计算细胞存活率及治疗指数(TI) 并采用用统计学软件 SPSS11. 5 的 Probit 回归法计算半数有效浓度( IC50) 。试验重复 3 次,取平均值作为试验结果。 细胞存活率( %)= (试验组 A 值/ 对照组 A 值) 100 %TI = TC50/ IC50124 光学倒置相差显微镜观察细
11、胞的形态学变化 细胞培养96h 后，IC50 下,光学倒置相差显微镜下观察并比较各组的细胞形态。13 统计分析使用 SPSS11.5 专业统计软件进行数据分析。实验数据以平均数标准差(s)表示,各试验组与病毒对照组间差异性采用 t 检验,P0.05 认为有显著差异。2 结果21 药物的细胞毒性GCV、茵陈水溶性提取物溶液分别在 50mgL-1 ，500 mgL-1 以内均未见明显的细胞毒性作用,但经较高浓度的药物作用后,细胞死亡数增加,药物有明显的细胞毒性作用。GCV 及茵陈水溶性提取物对 HEL 细胞毒性作用表现为: 细胞变大变圆,颗粒增多,少量细胞聚集成团,培养液混浊,折光性增强以及吸光值
12、明显改变。注射用更昔洛韦200，100，50，25，12.5，6.25，3.2mgL-1 对 HEL 细胞的细胞存活率分别为 4.15%，66.8%，82.6% ，90.1% ，97.8%，98% ，99%；茵陈水溶性提取物溶液不同药物浓度时(2000，1000，500，250，125，63，32mg.L-1) 对 HEL 细胞的细胞存活率分别为18.6%，51.7%，81.8%，87.5%，90.8%，98%，100% 。用统计学软件 SPSS11. 5 的 Probit 回归法,计算药物的半数毒性浓度 TC50 分别为 98.8mgL-1 和 904.49 mgL-1 。22 GCV 及中
13、药对巨细胞病毒增殖的抑制作用HCMV 对 HEL 的 CPE 的表现为细胞肿胀,变大变圆,折光性改变,胞浆内颗粒增多。将 GCV 以 50, 25, 12.5 ,6.25，3.2mgL-1 ; 茵陈水溶性提取物溶液以500，250，125，63，32mg.L-1 进行抑制 HCMV 实验, 大于32mg.L-1 浓度的茵陈水溶性提取物溶液均表现出较强的抑制病毒对细胞的病变作用。经统计分析,5 种不同浓度下茵陈水溶性提取物溶液均具有抗病毒作用,结果见表 1。用统计学软件 SPSS11. 5 的Probit 回归法,计算出 GCV、茵陈水溶性提取物溶液对 HEL 细胞的半数有效浓度( IC50 )
14、 分别为 9.6mgL-1 , 195.11 mgL-1 。同时,采用前述的公式可计算出 GCV、茵陈水溶性提取物溶液对 HEL 细胞的治疗指数(TI) 分别为 10.29, 4.64。表 1 GCV 和茵陈水溶性提取物溶液抗巨细胞病毒效应（测定OD 值）（略）注：与病毒对照组比较，* P 0.05。23 茵陈水溶性提取物溶液及 GCV 抗巨细胞病毒作用的比较在 IC50 下,检测茵陈水溶性提取物溶液和 GCV 抗巨细胞病毒的作用。经比较,发现茵陈水溶性提取物溶液的抗巨细胞病毒作用(A值) 与 GCV 组比较差异均有显著性(P0.05) , 且 GCV 组的平均A 值高, 表明茵陈水溶性提取物
15、溶液抗 HCMV 作用较 GCV 弱。结果在 IC50 下 GCV(9.6 mgL-1) 、茵陈水溶性提取物溶液 (195.11mgL-1) 的抗巨细胞病毒作用( 测得 A 值)分别为(0.7110.003) , (0.6630.004) , P0.05。在 IC50 下, GCV 和茵陈水溶性提取物溶液对 HCMV 的抑制率分别为 58.7 %和 42%。病毒抑制率= （药物处理组 OD 值- 病毒对照组 OD 值）/ （细胞对照组 OD 值- 病毒对照组 OD 值）100 %24 不同药物致 HEL 的形态学变化细胞培养 96h 后，IC50 下,光学倒置相差显微镜下可见：细胞对照组细胞贴
16、壁生长，增殖活跃，细胞成梭型紧密排列，有极少量圆形增殖细胞，见图 1；病毒对照组大量细胞变圆并脱离瓶壁，还可见到少量细胞碎片，仅少量细胞贴壁，无增殖细胞，见图 2；茵陈水溶性提取物+ 病毒组大部分细胞贴壁生长，见一些圆型细胞在液体中漂浮，约 45%细胞变成圆型或发生肿胀，其余贴壁细胞未见异常变化，见图 3；更昔洛韦+病毒组细胞均贴壁生长，约 20%细胞变成圆型或发生肿胀，其余细胞未见明显异常变化，见图 4。4 组细胞的形态学改变形象表明茵陈水溶性提取物具有抗 HMCV 的效用，其对 HMCV 的抑制作用较更昔洛韦弱。图 1 细胞对照组(40)（略） 图 2 病毒对照组(40)（略）图 3 茵陈
17、+ 病毒组(40)（略） 图 4 更昔洛韦+病毒组(40)（略）3 讨论中药茵陈为菊科植物茵陈蒿(Artemisia capillarisThunb)或猪毛蒿(Artemisia Scoparia Wald st. et Kit. 又名滨蒿) 的干燥地上部分,首载于神农本草经,性微寒,味苦、辛。有清热利湿,利胆退黄的功效。主要用于黄疸尿少,湿疮瘙痒,传染性黄疸型肝炎等症,是临床上常用的保肝中药。近年来有关茵陈的化学成分及药理作用的研究报道甚多,一些新的有效成分及药理作用不断被发现,茵陈除具有利胆保肝的作用外,还具有抗病原微生物、抗癌、降血脂、抗动脉粥样硬化(AS) 、兴奋平滑肌等多方面的活性。
18、复方茵陈一直都是解放军 302医院乙型肝炎治疗的首选药物。本研究的体外实验证明, 茵陈水溶性提取物溶液能有效抑制HCMV 在细胞内的繁殖。其半数有效浓度为 195.11 mgL-1,治疗指数为 4.64。与病毒组比较,有显著性差异(P0.05) 。茵陈水溶性提取物溶液在半数有效浓度时,表现出较强抑制病毒对细胞的病变作用,且随药物浓度的增高抑制作用增强。实验还显示茵陈水溶性提取物溶液在 32500mgL-1 浓度时对巨细胞病毒均有明显抑制作用，说明该药的有效浓度范围宽，使用安全范围大。姚艳红等6研究表明茵陈可抑制 2.2.15 细胞 HBsAg 和HbeAg 的复制和表达,对细胞培养上清和细胞内
19、 DNA 复制有抑制作用，该药在抗 HCMV 国内外尚无报道。本研究表明 , 茵陈单体溶液能有效抑制 HCMV 在细胞内的繁殖。姚艳红等6研究认为该药抗乙肝病毒的作用机理可能是抑制细胞内的 DNA 复制。该药抗HCMV 机制可能与之有相似之处，但仍需深入研究。综上所述,茵陈水溶性提取物溶液抗 HCMV 的效应尽管比更昔洛韦弱，但其作为中草药提取物有着价位低、毒副作用小、口服方便、长期使用不易耐药等特点，本实验已经证实了茵陈水溶性提取物溶液对 HCMV 有较明显的抑制作用，待深入研究其抗病毒的作用机理和进行动物实验研究取得疗效后，该药可推广到临床进行预防 HCMV 感染和治疗 CMV 病，对肾移植术后巨细胞病毒感染的防治也将取到积极作用。
