1、实验材料：1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6 及阳性对照 Bacmid/CAT，已构建成功。2. 昆虫细胞 Sf9、High Five 及其相关培养基、转染试剂均购自 Invitrogen 公司。抗 His 单克隆抗体购自 Oncogene 公司，CAT-ELISA 试剂盒购自 Roche。实验步骤：一、 昆虫细胞转染：1 Sf9 细胞计数，取 6 孔板中的两孔，每孔加入 910 5 个细胞( 其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少 1 小时，使细胞贴壁。2 准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a. 溶解 1g 纯化重组杆状病毒重组质粒于 100l 无添加成分的 Graces
2、Medium。b. 转染试剂充分摇匀后取 6l 加入 100l 无添加成分的 Graces Medium，混匀。c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育 20min。3 重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以 2ml 无添加成分的 Graces Medium 洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。4 取 0.8ml 无添加成分的 Graces Medium 加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为 1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27继续培养 5h。5 移除质粒、转染剂混合物，加入 2ml 全培。27湿盒孵育，直到病变现象产生。二、 病毒贮液的制备：1. 病毒感染晚期（正常
3、24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g 离心 5min，去除细胞和碎片。2. 上清即为 P1 病毒贮液，移入新的离心管中 4避光保存。长期保存分装冻存于-80 。3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒 P1 贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)=MOI(pfu/cell) 细胞数病毒贮液效价 (pfu/ml)注：若不进行病毒空斑测定，P1 贮液效价按照 110 6 到 110 7 计。4. 扩增 P1 液制备 P2 病毒贮液方法如下：a. 转染当天，取 2106 个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少 1h。b. 每孔加入适量的 P1 贮液，
4、27湿盒孵育 48h。c. 根均细胞病变情况（约 48h 后）收集各孔中的病毒上清液， 500g 离心 5min 取上清，即为 P2 病毒贮液。4避光保存。长期保存分装冻存于-80。d. 制备了高效价的 P2 液后，按上述方法扩增 P3 贮液，用于高效表达。三、 病毒贮液初步鉴定1. SDS-PAGE 蛋白电泳：取 P2 或 P3 病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行 SDS-PAGE 蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。 CAT-his 融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his 融合蛋白分子量约为 34KDa。2. western blot：以小鼠抗 his 单克隆抗体鉴定在相
5、应条带出是否有 his 标记。3. 以 CAT-ELISA 检测试剂盒检测 Bacmid/CAT 对照的蛋白表达情况。方法详见 CAT-ELISA 试剂和说明书。结果1. CAT-ELISA 检测试剂盒成功检测出对照 CAT 质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细胞中。2. 蛋白电泳和免疫印迹均看见对照 his-CAT 蛋白表达，但不见我想表达的非结构蛋白 his-nsp-6。在接下来的这段时间里，一直在进行条件的摸索，现在把这段时间的结果报告一下：1. 利用细胞 DNA 提取试剂盒提取感染细胞的 DNA，用针对目的基因的特异性引物以PCR 的方法鉴定，发现结果呈阳性，表明该质粒成功转染，但为何不表达，仍需摸索。2.根据上述结果，在后续的实验当中发现用感染的细胞涂片，使用特异性针对目的蛋白的抗体做免疫荧光鉴定，发现呈阳性，这一点证实转染的质粒成功且有蛋白表达，问题是为什么表达量如此低，以至于免疫印迹检测不出来？下一步将要进行的工作是，摸索如何提高蛋白表达量的方法，使用空斑纯化获得较纯的病毒不知道能不能提高蛋白表达量？这一点，也请有经验的站友给与指导，谢谢！
