1、1,第八章 沉淀技术,概念：加入有机或无机沉淀剂或改变环境条件，使目标物溶解度降低而沉淀下来的分离方法。,分类：盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；成盐沉淀法等。,从液相中析出固相，属初级分离纯化技术 具有浓缩和初步分离作用,缺点：形成不定形固体颗粒，构成成分复杂，易夹杂共存的杂质、盐、溶剂等物质。,2,原理： 1. 盐离子的水合作用降低了自由水的浓度，摧毁了蛋白质的水化层，疏水区露出使生物分子相互聚集而沉淀。 2. 盐离子中和了蛋白质表面的电荷。,第一节 盐析沉淀法, 低盐浓度盐溶，高盐浓度盐析,一、盐析原理,概念：利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐
2、，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。,3,硫酸铵缺点： 水解变酸；高pH释放氨气；残留影响风味；有一定的毒性。,二、常用的盐析剂,常用盐析剂：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠等,选择依据：价廉，废液可肥田分级效果好溶解度大且随温度变化小能使蛋白质稳定,4,硫酸钠：低温时溶解度较低，但不含氮，适于热稳定性高的胞外蛋白的盐析。 磷酸盐、柠檬酸盐：缓冲能力强，但溶解度低，易与某些金属离子生成沉淀。,其他几种盐的特点：,5,1.加50mmol/L磷酸缓冲溶液，防止变酸。 2.进行硫酸铵盐析要预先进行分级试验，逐级沉淀分离。 3.温度升高蛋白质溶解度降低（高盐），一般控制在4左右。 4. p
3、H一般控制在等电点。 5. 盐析沉淀产品最后要脱盐。,三、硫酸铵的使用规则,使用硫酸铵应注意的问题：,硫酸铵的加入方式：直接加入固体粉末加入硫酸铵饱和溶液,应用：免疫球蛋白和酶的提取纯化，中药三七皂甙的提取，人干扰素等,6,机理：1.亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，溶质分子的水化度降低，溶质分子间静电引力增加，易聚集形成沉淀。2.亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。,第二节 有机溶剂沉淀法,一、原理,概念：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。,7,优
4、点：溶剂易蒸发除去或离心除去，分辨率较盐析高 缺点：易使蛋白质变性；溶剂易挥发、易燃、易爆，安全性要求高；使用量较大，成本高,二、常用的有机沉淀剂,乙醇、丙酮,选择时考虑的因素： 介电常数小，沉淀作用强 对生物分子变性作用小 毒性小，挥发性适中 能与水无限互溶,丙酮：沉淀作用大于乙醇，沸点较低易损失，燃点低，有肝脏毒性,乙醇：沉淀作用强，沸点适中，无毒，最常用,8,低温、少量多次加入，加入时缓慢搅拌有机溶剂加入水中发热，控制温度等电点沉淀控制适宜pH值，注意使同种溶液中目的物与主要杂质带同种电荷少量盐存在能保护蛋白质助沉剂：低浓度的单价盐，如醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等；Zn2+、Ca2+等,三、使用原则,9,第三节 等电点沉淀法,原理：两性电解质，在溶液pH处于等电点（pI）时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。调节溶解的pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作。,优点：操作简便，溶剂消耗少，引入杂质少,缺点：等电点沉淀常不完全,等电点沉淀法的操作条件：低离子强度；pHpI,10,第四节 非离子型聚合物沉淀,原理： 与有机溶剂沉淀法相似 空间排斥作用 沉淀剂： 聚乙二醇（PEG）为非离子聚合物，无毒，对蛋白质有保护作用，对后续纯化影响小。条件温和，沉淀较为完全。,HO（CH2CH2O）nCH2CH2OH,
