1、第七章 生物合成药物的分离纯化工程学基础,一、概述生物合成药物的分离纯化，其目的在于从发酵液或培养液中分离纯化成具有一定纯度、符合药典或其他法定标准规定的各种药物，又称发酵液的后处理或下游加工过程。这是生物工程中的一个重要组成部分，它不但决定产品的质量和安全性，也决定着产品的收率与成本。 生物合成药物的一般分离纯化方法发酵液 预处理固液分离 初步纯化（提取） 高度纯化（精制） 成品加工,（1）发酵液的预处理与固液分离预处理：酸化、加热降低发酵液的粘度，或加入絮凝剂使生物细胞或溶解的大分子杂质聚集成较大的颗粒，便于沉降除去。分离方法：过滤和离心分离 （2）初步纯化吸附法、离子交换法和溶剂萃取法：
2、抗生素等小分子物质的提取；沉淀法：蛋白质类生物活性物质的提取，也可用于抗生素等小分子物质的提取（起浓缩作用，但纯化的效果较差）；双水相萃取和反胶束萃取：酶和蛋白质类生物药物的提取和分离；超临界萃取：食品工业和生物工程；超虑：大分子物质的脱盐与浓缩。 （3）高度纯化（精制）离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、聚焦层析、疏水层析等。 （4）成品加工浓缩和结晶， 产物为注射用：在结晶前进行除菌和去热原（加入活性炭吸附经石棉虑板过滤），产品为固体须干燥。,二、发酵液的预处理和固液分离 发酵液的预处理（抗生素为例） （1）控制PH和一些高价金属离子的去除草酸：改变发酵液胶体状态和去除Ca离子，三聚磷酸钠：
3、可去除Mg离子等黄血盐：可去除Fe离子等 （2）杂蛋白质的去除等电点沉淀法、变性沉淀法、加各种沉淀剂、加絮凝剂 （3）多糖的去除酶将其转化为单糖，降低粘度，提高虑速 （4）有色物质的去除离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等 2. 发酵液的固液分离过滤：真空鼓式过滤机和板框压滤机离心：管式离心机、叠片式离心机和三项倾析离心机,微生物细胞的破碎机械法：高压匀浆法、高速珠磨法、超声波法非机械法：化学渗透法、酶解法、冻结融化法、干燥法等。 三、溶剂萃取法传质速度快、分离效率高、便于连续操作和自动控制等优点。抗生素、有机酸、维生素和甾体激素等均用此法。 影响萃取的因素PH值、温度、盐析作用、溶剂的选择
4、2. 反应萃取：抗生素的提取 3. 双水相萃取：蛋白质、酶、核酸的等生物大分子 4. 反胶束萃取：酶和活性蛋白质等生物物质 5. 超临界流体萃取：CO2、氨、水等,四、离子交换法是利用某些生物药物能在溶液中形成带电粒子，与合成离子交换树脂之间结合力的差异来进行分离的方法。,1. 离子交换树脂的分类强酸性阳离子交换树脂(-SO3H)弱酸性阳离子交换树脂(-COOH,酚羟基）强碱性阴离子交换树脂（三甲氨基等）弱碱性阴离子交换树脂（-NH2,-NHR等） 2. 树脂和操作条件的选择树脂选择：强碱性产物宜选用弱酸性树脂、弱碱性产物宜选用强酸性树脂、强酸性产物宜选用弱碱性树脂、弱酸性产物宜选用强碱性树脂
5、,3. 离子交换操作条件的选择操作过程：交换吸附、洗脱（解吸）和树脂再生交换吸附：选取溶液在交换过程的PH值是该操作的基本条件；洗脱（解吸）：是吸附的逆过程，洗脱条件和吸附条件相反，在酸性下吸附应在碱性条件下洗脱，在碱性条件下吸附应在酸性条件下洗脱；树脂再生：让使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。,4. 应用实例庆大霉素的提取和纯化： 苯乙烯强酸性阳离子交换树脂吸附（PH77.5） 洗涤树脂 洗脱（1mol/L氨水）树脂脱色 浓缩 酸化（PH4.55.5） 活性炭脱色 无菌喷雾干燥 成品,五、吸附法,吸附法是利用一些吸附剂，在适宜的PH条件下，使发酵液中所需的产物被吸附剂吸附，然后再用适当
6、的洗脱剂将产物解吸，以达到浓缩和提纯的目的。 吸附的类型物理吸附、化学吸附、离子交换吸附。 影响吸附的因素吸附剂的性质、吸附物的性质、溶剂和温度的影响、PH值和其他组分的影响。 几种常见的吸附剂按化学结构分：有机吸附剂如活性炭、纤维素、聚酰胺、大孔树脂等；无机吸附剂如白土、氧化铝、硅藻土等。,六、沉淀法,优点：简单、经济、浓缩倍数高等。 应用范围：抗生素、氨基酸、酶、多肽、蛋白质、核酸等的提取分离 盐析法定义：在高浓度中性盐存在下，他们在水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。应用范围：主要适用于酶、蛋白质等生物大分子。优点：无机盐不易引起蛋白质的变性失活，非蛋白质杂质很少沉淀，设备简单，操作方便。,
7、影响盐析的因素 盐析剂的种类和数量: MgSO4,(NH4)2SO4,Na2SO4,NaH2PO4； 盐析的温度与PH值： 以不降低酶活为原则，多数在常温下进行盐析，在等电点处沉淀； 溶液中的杂质： 以最大可能沉淀出需要的酶为原则。 2. 有机溶剂沉淀法定义：在水溶液中加入一定量亲水性有机溶剂，以降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的方法；应用范围：蛋白质、酶、核酸、多糖等物质的分离；,特点：分辨率高于盐析沉淀法，溶剂沸点较低回收方便，但易使蛋白质变性失活，通常在低温下操作，以减少变性作用。 影响沉淀的因素 溶剂的种类和用量：甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮等； 温度与PH值：低温有利于沉淀，提高收率，PH
8、值在等电点附近较好； 3. 等电点沉淀此法主要应用于两性电解质产物，并且在等电点时溶解度很低的产物，如谷氨酸、四环素等。 4. 其他沉淀方式形成难溶性盐或复合物的沉淀法、加高分子聚合物沉淀。,七、色谱分离法（层析法）优点：分离效率高、设备简单、操作方便，无需加热等。 色谱分离法的分类及操作方式（1）色谱法的分类按两相所处的状态液相色谱：以液相作为流动相气相色谱：以气相作为流动相,按分离过程的机理 吸附色谱：依靠各组分对固定相的吸附力不同而分离； 分配色谱：依靠各组分在两相的分配系数不同而分离； 离子交换色谱：依靠各组分对离子交换剂的化学亲和力不同而分离； 凝胶色谱：依靠各组分的分子大小或形状不
9、同而分离。 按操作形式分 柱色谱：将固定相装在柱内，使混合物溶液沿一个方向移动而得以分离,如HPLC； 纸色谱：用滤纸作为固定相载体，混合物溶液点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的； 薄层色谱：在玻璃板（或其他材料）上涂布固体粉末薄层为固定相，点样后用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。,（2）色谱分离法的进行方式 洗脱法：应用于柱色谱法中； 展开法：应用于纸色谱和薄层色谱法。八、结晶与重结晶制备纯物质的有效方法，应用于许多抗生素、维生素、氨基酸等生物药物的提纯。结晶步骤：过饱和溶液的形成、晶核的生成、晶体的成长。重结晶：将晶体用合适的溶剂溶解后再次进行结晶，以提高纯度。,九、成品干燥1. 直接干燥气流干燥、喷雾干燥、沸腾干燥等。 间接干燥真空干燥、冷冻干燥、辐射干燥（红外线及远红外干燥）。 介电干燥高频干燥和微波干燥。,返回,返回,返回,返回,
