1、探索抗原特异性 T 细胞应答的新工具Dimer X 抗原呈递技术简单易行的3步曲：加载抗原 -染色-分析 前言 主要组织相容性复合物（MHC）基因座编码一组高度多型的细胞表面蛋白，后者在机体对抗原的免疫应答中发挥关键作用。MHC 分子通过结合和向 T 细胞抗原特异性受体（TCR ）呈递抗原片段发挥功能。人( 人白细胞抗原 / HLA)和小鼠( 组织相溶性抗原2/ H-2）MHC 分子是在结构和功能上都具有相关性的蛋白质，主要包括两种类型。MHC I 类分子包含两个多肽链。 链是由 MHC 编码的跨膜多肽，含有三个胞外结构域：1，2和 3。第二条链包含一个非 MHC 编码的多肽2微球蛋白（2M）
2、 。由于2M 不具有跨膜结构域，它与 链通过非共价作用连接。外源性 Ag 经水解形成的肽段与MHC 分子结合，形成 Ag/MHC复合物继而表达在细胞膜上，被 CD8T 细胞（TC 细胞）的 T 细胞受体识别，产生 CTL（细胞毒性 T 细胞）免疫。MHC II 类分子包含两个不同的跨膜蛋白，结合外源性抗原（如细菌和真菌）衍生而来的肽段，并被 CD4+T 细胞特异识别。内源性 Ag 经水解形成的肽段与 MHC分子结合，形成 Ag/MHC复合物继而表达在细胞膜上，被 CD4T 细胞（TH 细胞）的 TCR 识别，诱导辅助性 T 细胞免疫。CD4和 CD8辅助分子与 MHC 分子的非多形区相互作用而
3、稳定 TCR -MHC 复合体的形成。机体受到抗原刺激后产生免疫应答，通过复杂的免疫反应最终清除抗原，保护机体。特异性免疫反应都是由 Ag 在 MHC 帮助下被呈递给 T 细胞，同时协同刺激分子传递 T 细胞活化的协同刺激信号到核内，从而 T 细胞活化、扩增并分化为效应细胞，产生效应分子，杀伤受感染细胞、癌细胞，清除病原体。MHC 不仅与移植排斥反应有关，也广泛参与免疫应答的诱导与调节。近来，在疫苗开发和特异抗原免疫应答等研究领域，以可溶性二聚体蛋白经免疫荧光鉴定和流式细胞术分析抗原特异性 T 细胞显示出越来越重要的作用。BD PharMingen 开发的DimerX 技术的是基于 MHC 对
4、抗原肽的自然免疫处理，这种处理是刺激抗原特异性 T 细胞所必需的。DimerX 试剂是由重组的可溶性 MHC:Ig 蛋白及 b2M 共同組成。适用于免疫荧光染色以及流式細胞仪分析。DimerX 技术BD PharMingen 通过 DNA 重组技术将编码 MHC I 类分子的3个胞外结构域的 cDNA插入小鼠 IgG1重链基因可变区，再将含有融合基因的表达载体与人 b2M 基因共转染到一个 IgG 重链缺陷型鼠浆细胞瘤细胞系 J558L，细胞的分泌产物是由重组的 MHC:IgG1重链融合蛋白和以二硫键结合到重链的轻链，以及以非共价键与 MHC 结合的 b2微球蛋白形成的复合物。该重组分子有2个
5、抗原片断结合沟，研究者可自行加载任意感兴趣的抗原片断，再以 PE 标记的 anti-Ms IgG1与 MHC:IgG1结合，经免疫荧光染色或流式細胞仪分析呈桔黄色荧光。以 FITC 标记的 anti-CD8染色 CD8 T 细胞，经 FCM 分析呈绿色荧光。由此，同时呈现桔黄色和绿色荧光的细胞即为针对目标抗原与 MHC I 复合物的特异杀伤性 T 细胞。BD PharMingen DimerX 产品特性：鉴定 Ag/peptide 特异性 T 细胞模拟特异性的 MHC-Ag-TCR 相互作用具有功能性的 DimerX 易于加载研究者感兴趣的任意抗原肽高亲和力的 DimerX 加载肽后能与相应的
6、抗原特异性 T 细胞长时间稳定结合IgG 的铰链区的可运动性使连接在臂上的 MHC 与 TCR 更加自由、灵活的结合大大增强了其结合抗原特异性 T 细胞的功能实验流程（3步法） 加载抗原肽段（无菌操作）1.1 制备目标抗原肽段贮存液：将肽段溶于 DMSO 制成20mg/ml stock 液，可以小量分装冻存于20。至使用时，以无菌的 PBS 稀释至2mg/ml 即可。1.2 肽段与 DimerX 混合于 PBS(0.2%BSA) pH7.2 (554657),肽段过量比例40, 160, 640.（肽段为 8-10 aa,纯度95%（HPLC） ）肽段用量 Mp (mg)可用此公式估算：Mp=
7、Md RDp/DdDp肽段分子量(dalton)， Dd250,000 daltons，R过量肽与 Dimer 的摩尔比(40,160, 640)，MdDimer 用量 （H-2Kb,d:Ig 为0.254 mg/106 cells/ test，HLA-A2:Ig 为 12 mg /106cells/test）1.3 肽段与 Dimer X 混合液于37孵育1 h 或过夜，或4, 48 h（抗原肽与 HLA-A2:Ig 需孵育过夜）*以上为针对高亲和力的目的肽段，用被动加载方法即可达到很好的效果。如果目的肽段与 MHC 亲和力很低，当被动加载效率不高时，可以选用主动加载方法提高加载效率（如酸/
8、碱解吸法加载略） 。*被动加载的 Dimer X/peptide 复合物可在4 保存一周，主动加载的复合物可在4 保存12天。染色2.1将待检细胞悬于 PMG 染色液 (554657)，106细胞/50ml2.2阻断 FcR 以降低非特异性染色背景*小鼠细胞用 BD FcBlock(553141/553142)，1 g/106 cells*人细胞用纯化的人多克隆 IgG，2 g/106细胞或10%正常人血清，室温10 min2.3加入 DimerX/peptide（0.25，1，4 g） ，于4孵育1 h，用染色液洗涤2.4重悬于100ml 含二抗 (550083:Anti-Ms IgG1,
9、PE)的染色液4，0.51 h分析3.1洗涤2次，重悬于 0.5 ml 染色液，上 FCM 检测，或用荧光显微镜检测。FCM 获取细胞数据时，至少采集510万淋巴细胞数。3.2阴性对照的设立：将无关肽段与 DimerX 孵育或用未加载任何肽段的 DimerX。注意事项：多色分析时加入的针对细胞表面标志抗体(如: CD3, CD8)不能是小鼠 IgG1，否则将与二抗(Anti-Ms IgG1,PE)结合导致非特异性染色。对于此种情况，可先将 Dimer X/Ag 复合物与二抗孵育结合，加 purified Mouse IgG1(553485)室温孵育30min (封闭残留的二抗结合位点) ，再将
10、此混合液与染色细胞表面 Ag 的抗体一起与细胞孵育。则可得到低背景、高信噪比、快速、重复性好的结果。实验结果实例（图2）对照组:空载的 HLA-A2:Ig DimerX 实验组:加载 CMVpp65的 HLA-A2:Ig DimerX 图2 为用 BD DimerX 产品通过流式细胞分析检测巨细胞病毒（CMV）血清抗体阳性病人 PBMC 中 CMV pp65特异的杀伤性 T 细胞；并以未加载肽段的 HLA-A2:Ig DimerX 为阴性对照。上图所示百分数为被 CMV pp65:HLA-A2/Ig 染色的特异性CD8+T 细胞数的百分比。加载：以摩尔数640倍过量的 CMV pp65肽段与纯
11、化的 HLA-A2:Ig DimerX 孵育；染色：以 PE 标记的 anti-mouse IgG1(551347)为二抗。同时加入 anti-CD14-APC和 anti-HLA-DR-APC 染色非 T 细胞，以 anti-CD8-FITC 染色 Tc 细胞；分析：流式细胞术获取数据时，排除 APC+(即 CD14+和 HLA-DR+)细胞，选取FITC+(即 CD8+)细胞。新产品聚焦NK T 细胞功能研究之利器人和小鼠主要组织相容性抗原(MHC)系统分别被命名为 HLA 系统和 H-2系统。HLA类抗原广泛分布于白细胞等所有的有核细胞表面，小鼠 H-2类抗原也广泛分布于各种组织、细胞的
12、膜表面，且小鼠成熟红细胞表面也有 H-2抗原。我们知道，MHC 基因编码经典MHC 分子和非经典 MHC 分子，如：人 HLA-A, HLA-B, HLA-C，小鼠 H-2K, H-2L, H-2D这些经典 MHC-I 类分子将肽类抗原呈递给细胞毒性 T 细胞。此外，还存在另一类重要的由非 MHC 基因编码的产物-MHC 样分子（MHC like） ，如：人 CD1(ad)，鼠 CD1这些MHC-I 类样分子。其中 CD1d 分子表达在造血细胞和胃小肠上皮细胞，不仅呈递肽类抗原，也呈递酯类、糖酯类抗原，这类抗原由 CD1d 分子结合并呈递给 NKT 细胞。NKT 细胞（NK1.1T 细胞）是
13、T 细胞中一个独特的亚群，1987年由 Budd 等首次报道，其发育、表型及免疫功能与 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞均不同，在自身免疫疾病（如糖尿病）以及肿瘤免疫中起关键作用，因而近年来受到十分重视。NKT 细胞的免疫功能主要是细胞毒和免疫调节作用。一旦被活化，NKT 细胞就具有强大能力产生免疫调节因子如 IL-4, IL-10, IFN-g 等，强有力地影响获得性免疫应答反应，NKT 细胞胞浆颗粒中，含有穿孔素，可通过穿孔素发挥细胞毒作用，并表达广泛的细胞死亡效应分子，参与急性移植物排斥反应，抗菌、抗病毒免疫，抗肿瘤免疫等。BD CD1d:Ig：研究特异性 NKT 细胞功能新工具如图3
14、CD1d:Ig 是 CD1d 分子的 MHC I 类样分子胞外结构域和小鼠 IgG1重链可变区的融合蛋白，与 b2M 图3 (dimerx-图3.jpg)共表达于小鼠浆细胞瘤细胞系 J558L。加载目标抗原（糖酯类抗原）后，可用免疫荧光染色或流式细胞术分析特异性 NKT 细胞。目前，BD Pharmingen 提供纯化的 MHC I:Ig 和 CD1d:Ig 可溶性二聚体产品，并且正进一步研发直接荧光标记的 DimerX 产品。DimerX 产品一览： H-2Kb:Ig PURE 550750 0.25mg H-2Ld:Ig PURE 550751 0.25mg H-2Db:Ig PURE 551323 0.25mg HLA-A2:Ig PURE 551263 0.05mg human CD1d:Ig PURE 557764 0.1mg mouse CD1d:Ig PURE 557599 0.25mg Human b2 Microglobulin 551089 0.1 mg 相关产品Anti-Mouse IgG1, PE 550083 0.1mgStain Buffer (BSA) 554657 500 mlBD FcBlock（小鼠）PURE553141/553142 0.1/0.5mgMouse IgG1, k PURE 553485 0.5mg
