1、1广西地方标准陆川猪及其肉制品的分子定性鉴定方法（征求意见稿）编制说明一、工作简况(一) 任务来源根据广西壮族自治区质量技术监督局2016 年第一批广西地方标准制定（修订）项目计划的通知（桂质监函2016198 号）文。(二) 起草单位起草单位：广西大学、广西分析测试研究中心、广西经贸职业技术学院、广西陆川县质量技术监督局。(三) 主要起草人姓 名 性别 职务/职称 工作单位 任务分工黄丽 女 副教授 广西大学 项目负责人黄磊 男 研究生 广西大学 鉴定方法研究，标准研制杨磊 女 高级工程师 广西经贸职业技术学院 标准研制黄岛平 男 高级工程师 广西壮族自治区分析测试研究中心 调研论证庞理松
2、男 局长 陆川县质量技术监督局 原料收集，调研夏宁 女 副教授 广西大学 PCR 方法研究林葵 女 高级工程师 广西壮族自治区分析测试研究中心 调研论证韦保耀 男 教授 广西大学 标准研制滕建文 男 教授 广西大学 资料收集、组织协调、统稿庞丽 女 副局长 陆川县质量技术监督局 原料收集杜寒春 女 高级工程师 广西壮族自治区分析测试研究中心 调研论证二、制定标准的必要性和意义陆川猪因其原产于广西壮族自治区东南部的陆川县而得名，是中国华南地区的优良猪种，主要分布于广西玉林、梧州、钦州等地区。是“中国八大地方优良猪种”之一。陆川猪属于小型脂肪型猪种，但其皮薄肉嫩、脆而不腻、味道鲜美、营养丰富。其畜
3、产品可加工成香肠、2无皮五花腊肉、白切猪脚、脆皮乳猪、扣肉等制品，产品价值非常高，不仅深受国内消费者的青睐，更有受到海外消费者的欢迎。然而由于纯种陆川猪本身饲料率低、饲养周期相对较长，为了满足市场需求而以纯种陆川猪为母本与国内外其他的优良猪种进行杂交，得到了高饲料率、短周期的二代陆川猪（称为二元杂猪，例如大陆二元杂）和三代陆川猪（称为三元杂猪，例如大陆长白三元杂）。二元杂猪与三元杂猪的出现弥补了纯种陆川猪的不足，丰富了消费者的选择，提高了陆川猪品牌的价值。新事物的出现也常常伴随着问题，由于陆川猪肉自身的优势，市场上陆川猪肉的价格常常是普通猪肉价格的两到三倍，这种价格的差异诱导了很多不法分子对陆
4、川猪生鲜肉及熟肉制品掺假造假的违法现象。有些不法商贩将普通猪肉混入陆川猪肉，以次充好，更有甚者以普通猪肉的生鲜肉或者熟肉制品假冒陆川猪肉进行销售，牟取不法利润，这样的做法不仅扰乱的肉类市场，欺骗了消费者，打击了陆川猪的的整个产业链的积极性，严重影响了陆川猪品牌的长远发展。目前对陆川猪肉与普通猪肉进行鉴伪的方法较少，监管体系尚未建立起来。在目前的陆川猪研究中，国内学者主要从分子生物学角度，研究了陆川猪的遗传与繁殖、猪支原体肺炎病原分子致病机制，并开发了保健扣肉、腊肠、火腿等一系列的陆川猪肉制品。但是针对陆川猪的鉴定技术研究中，鲜有报道。仅有广西大学何若钢等对杜洛克与陆川猪杂交后代进行过肉质研究，
5、在研究中也发现，虽然色差计、嫩度仪、酸度计、电镜等仪器在数据上能直观的反映出肉制品的品质，但肉质指标大多没有统一的数值范围，个体差异也比较明显，不能作为区别陆川猪及其他品种猪的重要依据。ISSR-PCR 方法采用可靠的 DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了陆川猪、陆川猪杂交品种、巴马香猪、瘦肉型猪及其肉制品之间的区别，为广西陆川猪鉴别技术标准研究奠定了基础。但是，遗憾的是前期研究尚未形成能够实施的标准。而且由于陆川猪系的杂交后代品种较多、且目前 NCBI文库尚未检索到陆川猪系的全基因序列，陆川猪的全基因组学研究进展缓慢，为陆川猪系（纯种、二元杂、三元杂等陆川猪）的 DNA的定量鉴别技术研究带
6、来了很大的难度。因此，针对肉类鉴伪识别技术的发展以及肉类成分鉴定标准现状，在前期陆川猪的 DNA分子鉴定技术的研究基础上，拟进一步扩大陆川猪的样本、扩大样品的产地，进一步完善ISSR分子标记鉴定陆川猪系及其肉制品的方法，优化反应体系、研究扩增体系的稳定性和灵敏度。建立标准化陆川猪及其肉制品的 PCR定性检测方法，为政府部门规范和监督相关食品企业生产提供法律依据，为保护消费者食品安全提供有力的保障。三、主要起草过程3（一）成立标准编制小组，确定编写方案项目立项后，广西大学立即成立标准编制小组，确定陆川猪及其肉制品的分子定性鉴定方法标准制定方案。（二）收集资料，撰写工作组讨论组通过检索、查阅相关文
7、献资料，收集了广西地区的陆川猪和部分非陆川猪样品，参照可实现的学者研究 ISSR鉴定方法，并联系厂家确定用于鉴定方法建立的部分样品。完成大量而充分的前期工作后，编制组开始着手撰写陆川猪及其肉制品的分子定性鉴定方法的工作组讨论稿。（三）调研论证，形成征求意见稿编制小组在充分讨论、研究及集体分析后，几经修改和讨论，完成了陆川猪及其熟肉制品的分子定性鉴定方法的征求意见稿。2016 年 3月在广西大学轻工与食品工程学院组织相关专家召开标准研讨会，确立鉴别方法使用 ISSR技术；2016 年 7月在广西大学轻工与食品工程学院组织相关专家召开标准研讨会，进一步完善方法的评价体系。2017 年 10月在广西
8、分析测试研究中心进行了试验方法的复验，认为鉴别方法整体可行、重现性好。四、制定标准的原则和依据（一）本标准按照 GB/T 1.12009给出的规则起草。（二）本标准编制遵循“科学、适度、可行”原则，标准的编写参考了 GB/T 21100-2007动物源性饲料中骆驼源性成分定性检测方法 PCR方法，GB/T 21101-2007动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法 PCR方法，GB/T 21106-2007动物源性饲料中鹿源性成分定性检测方法 PCR方法，GB/T 21107-2007动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法 PCR方法等国家标准，并结合试验结果为基本依据。五、主要条款的说明（一
9、）原理目前可行且得到实证应用的几种肉类掺假鉴定技术和特点。国内外应应用最为广泛的检测方法有近红外光谱鉴别技术、PCR 鉴别技术、酶联免疫法、色谱鉴别技术等。这些技术中，虽然近红外光谱检测检测的速度比较快，但是准确度方面还有待改进。酶联免疫法(ELISA)已有很成功的商业化应用出现，但由于于蛋白活性的影响，其应用范围也会受限。近年来色谱分析方法有了更深入的研究，随着高分辨质谱的出现，通过多肽鉴定肉类品种将是一个新4的研究方向。以为 PCR技术为主的 DNA分子鉴别技术包括长度多态（PCR-RFLP）、随机扩增多态性（PCR-RAPD）以及实时定量荧光 PCR(RT-PCR)最为成熟，应用最为广泛
10、。国内已将PCR检测技术作为鉴定肉类的标准方法，国家先后出台了牛、羊、猪、鹿、狗、马、驴、兔、骆驼肉的国家检测标准 1-8；农业部也出台了牛、猪和羊肉的检测标准 9-11。出入境出台的PCR技术检测肉类的行业标准最为全面，包括鸡、牛、水牛、山羊、绵羊、鸭、火鸡、鹅、狐狸、猪、狗、貂、鸽子、猫、马、驴、鹤鹑、鹅鸽、鳍鱼、鱿鱼、黄鱼、金枪鱼、安康鱼、石斑鱼、鳖鱼、河豚鱼等 11-14。所以综合来看，PCR 检测技术具有简单、特异性好、灵敏度高等优点。出现 ISSR-PCR技术是在基因扩增的时添加提前针对保守或特异序列设计的引物，再经过脱氧核酸体外扩增以及相应检测察看样品中是否含有目标基因。这种方法
11、由于引人为设计的特异性引物，免去了 DNA扩增后的测序和多态性分析过程，使得测试更加快速，在节省时间的同时还提高准确度。（二）仪器与试剂1 主要仪器与耗材普通 PCR 仪、电泳仪、凝胶成像设备、高速冷冻离心机、冷藏冷冻冰箱、漩涡振荡器、微量移液器（10 l、100 l 、 1 000 l）、0.2mL 普通 PCR 管、一次性 PE手套、1.5mL 离心管。2 主要试剂2.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或者生化试剂。2.2 实验用水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。2.3 DNA 提取试剂盒（Genomic DNA Isolation Kit Instruction Manu
12、al）。2.4 10X TAE 缓冲液。2.5 2X Es Taq Master Mix（含溴酚蓝染料）。 2.6 Marker 为 100 bp Plus DNA ladder。3.特异性引物。根据陆川猪线粒体细胞 TYRP1 基因的核苷酸序列设计引物，选用两个特异性较强、重现性好、带有重复碱基且上下游序列相同的陆川猪引物 17。上海生工生物工程公司负责合成引物。合成后的引物是白色干粉的形式，使用前先对其进行预处理，使用小型离心机对引物进行 2s 左右离心，后加入说明书上各引物的稀释所需体积的 TE 溶液，使引物浓度达到 100M，完成后将引物放入-20 冰箱中保存备用 。特异性引物序列如表
13、 1。表 1 特异性引物信息5检测基因 引物序列上游 5-CACCACCACGC-3WM12下游 5-CACCACCACGC-3上游 5-CTCCTCCTCGC-3WM14下游 5-CTCCTCCTCGC-3（三）肉制品制作方法将生鲜猪肉清洗、切分后，在 100 的水中煮约 15 min，直至肉色发生改变且内外表面无血水，取出冷却至室温即成熟肉样品。将生鲜猪肉样品经过清洗、切块后，在水温为 90 的水中预煮约 30 min，直至无血水，然后捞出冷却后，放入油温为 180 左右的油中炸1015 min，捞出冷却、切片并调味，即成为实验所需的扣肉样品 15。将生鲜猪肉样品切块、修整，把 2.5 %
14、的食盐，适量料酒、香辛料等充分混合后均匀地涂抹在肉品表面，并适当揉搓后放入 4 冰箱中腌制 1 d，待配料全部渗入肉内后取出，放入烘箱中，先用 40 的温度烘烤 2 h，然后把温度调至 55 烘烤约 36 h，待把腊肉烘干后取出即可成为实验所需的扣肉样品 16。（四）鉴定步骤1 样品 DNA提取按照通用型基因组 DNA 提取试剂盒（Genomic DNA Isolation Kit Instruction Manual）中动物组织基因组 DNA 提取操作进行提取 18-19。1.将待测的原料猪肉，去除肥肉后，用灭菌刀切分。提取时切取 0.5g 肉样，剪碎后用干净镊子或药匙转移至干净的离心管中；
15、2.向离心管中加入 400 l Buffer L1 和 20 l Foregene Protease，涡旋混匀，放置于 65金属浴或水浴中 25-30min，其间每间隔 10min 涡旋混匀一次，促进酶解；3.酶解完成后，加入 400l Buffer L2，颠倒混匀至分层消失，置于 65金属浴或水浴中 10min，然后 12000 rpm 室温离心 5-10 min，收集上清液；4.将上清液用移液器转移到离心柱中，再将离心柱放入收集管中，然后 12000 rpm 室温离心 1min，弃掉收集管中的废液；5.向离心柱中加入 500l Buffer PW，12000rpm 室温离心 1min，弃掉
16、收集管中的废液；6.再向离心柱中加入 700 l Buffer WB，12000rpm 离心 1min，弃掉收集管中的废液；将离心柱放回收集管中，12000rpm 空管离心 2min，弃掉离心柱中残余的 Buffer WB；7.将离心柱移至新的 1.5mL 离心管中，向膜中央悬空滴加 100 l 已于 65预热的Buffer EB，室温放置 5min，12,000rpm 离心 1min，收集洗脱液；68.再次向膜中央悬空滴加 100 l 已预热的 Buffer EB，12,000rpm 离心 1min，收集洗脱液；将两次收集的洗脱液合并，即得样品 DNA。DNA 提取后置于-20保存。2 DN
17、A纯度的测定检测提取 DNA 的纯度。取 5L DNA 溶液加灭菌水稀释至 1mL，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260nm 和 280nm 处的吸光值。DNA 纯度为 OD260 /OD28020。DNA 样品的纯度检测结果见表 2。表 2 DNA 纯度检测结果样品名 OD 260nm OD 280nm OD 260nm / OD 280nm纯种陆川猪生鲜肉 0.381 0.205 1.854纯种陆川猪熟肉纯种陆川猪扣肉纯种陆川猪腊肉0.3640.3880.376 0.2070.2110.2041.8531.8391.843二元猪生鲜肉 0.330 0.184 1.739二元猪熟
18、肉二元猪扣肉二元猪腊肉0.3590.3270.3340.1890.1760.1851.7931.8581.805三元猪生鲜肉 0.366 0.201 1.899三元猪熟肉三元猪扣肉三元猪腊肉0.3620.3780.3650.2030.2150.1831.7831.7581.995地方土猪生鲜肉 0.454 0.266 1.707地方土猪熟肉地方土猪扣肉地方土猪腊肉0.4770.4850.4330.2350.2470.2162.0301.9642.004地方黑猪生鲜肉 0.347 0.201 1.726地方黑猪熟肉地方黑猪扣肉地方黑猪腊肉地方黑猪猪毛地方黑猪猪血0.3390.3830.3760.
19、3750.3980.1970.1990.2000.2160.2141.7211.9241.8801.7361.860白条猪生鲜肉 0.290 0.150 1.733白条猪熟肉白条猪扣肉白条猪腊肉0.3200.2940.2760.1800.1580.1431.7781.8611.931结果表明，PCR 扩增的要求是提取 DNA 的 OD260 / OD280 要 达到 1.7 至 2.0 之间，而 DNA试剂盒提取法又高效又能提取达到 PCR 扩增要求，所以采用 DNA 试剂盒提取样品 DNA。采7用商业的化 DNA 试剂盒提取，效率高，质量好，且几乎对人体以及环境不存在污染。3 PCR反应体系
20、PCR 扩增体系的反应液共 25.0 l，反应所需的 2Es Taq PCR Master Mix 包含了 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl 2、反应缓冲液、PCR 反应的增强剂、优化剂、稳定剂以及溴酚蓝染料等，浓度为 2，体系如表 321。配置体系时在每个 PCR 管内按照表 3 从左至右的顺序依次加入试剂和模板，注意在加样时应使样品 DNA 模板溶液完全落入反应液中，不应粘附于管壁上，如若管壁上存在粘附残留，必须先进行离心使其全部落入管底，再将 PCR 管放入 PCR 仪内准备扩增。表 3 PCR 反应体系上游引物 下游引物2Es PCR Master Mix模板 DNA dd
21、H2O0.5 l 0.5 l 12.5 l 1.0 l 补足至 25.0l4 PCR反应程序在 PCR 仪表设置界面按照表 4 设定扩增程序进行 35 个循环扩增 22。表 4 PCR 反应程序预变性 变性 退火 延伸 总延伸 降温95 95 36 72 72 4 5 min 30 s 30 s 2 min 5 min 5 min5 实验对照阴性对照选取与陆川猪不同的猪种，考虑到市场存在以廉价猪肉代替陆川猪肉的现象，将地方土猪或地方黑猪或白条猪或其他非陆川猪按试剂盒提取提取 DNA，按表 3 配置 PCR反应体系，按表 4 程序进行 PCR 扩增；空白对照选取灭菌水代替 DNA 模板，按表 3
22、 配置PCR 反应体系，按表 4 程序进行 PCR 扩增 23。6 PCR反应运行设定好 PCR 仪的扩增程序后，检查 PCR 反应管是否摆放正确（检查各放反应管是否盖紧，以免反应液泄漏污染仪器），盖紧 PCR 仪器盖，开始运行仪器进行 PCR 反应。7 琼脂糖电泳检测扩增完成后，尽快进行电泳检测，使用微量移液器取 5 l扩增产物，加入到浓度为 1.0 %的琼脂糖凝胶（将凝胶托架两端用胶带封闭并水平放置在工作台上，放上梳子，使梳齿下沿距托架板 0.5mm 至 1.0mm； 配制足够量的凝胶：称取 1.0g 琼脂糖于三角瓶中，加入8100mL 1 倍 TAE 电泳缓冲液，加热溶解琼脂糖；待琼脂糖
23、溶液冷至 50 时，将胶液沿托架胶板边缓慢连续注入，让胶液自由流向各方，凝胶厚度控制在 3mm 至 5mm 之间。待凝胶完全凝固后，撤去两端胶带；将托架放入电泳槽中，加入 1 倍 TAE 电泳缓冲液，使之浸过胶面 2 mm，拔出梳子，以备加样电泳。）的上样孔中，同时加入 2l的 Marker，用 1TAE作为缓冲液，合闭电泳槽的盖子，开启电源开关，按 5 V/cm 设定电压，电泳 30 min24。8 紫外成像拍照电泳结束后，小心地将凝胶从电泳槽中取出，放入盛有适当浓度溴化乙锭的避光容器里染色 15 min 左右，染色完成后将凝胶转移到凝胶成像设备中观察拍照 25。获得相应的电泳图进行结果判定
24、。拍照获得相应的电泳图进行结果判定。若不能及时观察，应将凝胶放入1TAE 缓冲液中暂时保存，但不宜超过 4 小时。（五）结果判定与表述1 质量控制空白对照，在琼脂糖电泳检测中无条带，无菌水中不含 DNA，阴性对照在琼脂糖电泳检测中无条带，提取的地方土猪或地方黑猪或白条猪或其他非陆川猪的 DNA 中不含与 WM12和 WM14 结合的特异性位点。依据 BJS 201707植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定。2 结果判定将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统内观察，与标准 DNA 分子量比较，观察测试样品琼脂糖电泳检测图，如测试样品目标基因琼脂糖电泳检测有 1200 bp 和 900 bp 对应条带，则
25、判定为被检样品阳性，表明样品中含有纯种陆川猪的特异基因；如测试样品目标基因琼脂糖电泳检测无 1200 bp 和 900 bp 对应条带，则判定为被检样品阴性，表明样品中不含有陆川猪的特异基因；如测试样品目标基因琼脂糖电泳检测只有 900 bp 对应条带，则重复试验一次。如再次扩增后电泳检测仍只有 900 bp 对应条带，且阴性对照和空白对照结果达到指控要求，则判定被检样品含有陆川猪源性成分，表明样品中含有陆川猪（包括纯种与杂元猪）的特异基因。3 结果表述结果为阳性者，表述为“被检样品为纯种陆川猪”。结果为阴性者，表述为“被检样品为非陆川猪”。结果为含有陆川猪源性成分者，表述为“被检样品为杂元陆
26、川猪”。依据 BJS 201707植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定。（六）实验室防污染措施9按照 GB/T 2740 的规定执行。六、验证试验（一）特异性评价DNA 提取试剂盒,按照同样的方法，提取陆川猪、大陆二元杂猪、大陆长白三元杂猪和地方土猪、地方黑猪、白条猪的（生鲜肉、熟肉、扣肉、腊肉）DNA，用设计的引物 WM12和 WM14 对不同来源猪肉样品进行检测，在反应体系和扩增参数等相同的条件下进行 PCR及凝胶电泳检测，以评价该引物的特异性 26。特异性结果如图 1 至图 4。图 1 生鲜肉和熟肉特异性电泳图（WM12） 图 2 生鲜肉和熟肉特异性电泳图（WM14） 注：PCR 扩增时的退火
27、温度为 36 ，其中 Marker 为 100 bp Plus DNA ladder，加入量为2ul。1 至 13 号泳道分别为陆川猪、陆川猪熟肉、二元猪、二元猪熟肉、三元猪、三元杂猪熟肉、白条猪、白条猪熟肉、地方土猪、地方土猪熟肉、地方黑猪、地方黑猪熟肉、空白对照。样品加入量均为 5ul。10图 3 熟肉制品特异性电泳图（WM12） 图 4 熟肉制品特异性电泳图（WM14） 注：PCR 扩增时的退火温度为 36 ，其中 Marker 为 100 bp Plus DNA ladder，加入量为2ul。1 至 13 号泳道分别为陆川猪、陆川猪熟肉、二元猪、二元猪熟肉、三元猪、三元杂猪熟肉、白条猪
28、、白条猪熟肉、地方土猪、地方土猪熟肉、地方黑猪、地方黑猪熟肉、空白对照。样品加入量均为 5ul。如图 1 至图 4 所示，纯种陆川猪及其肉制品在引物 WM12 的条件下扩增，可在 DNA 分子量 1200 bp 处扩增出条带，而非纯种陆川猪则不扩增出此条带，引物 WM12 可用于鉴别区分纯种陆川猪与非纯种陆川猪（二元猪、三元猪）；陆川猪及熟肉制品在引物 WM14 的条件下扩增，可在 DNA 分子量 900 bp 处扩增出条带，而地方黑猪、地方土猪、白条猪则不扩增出此条带，引物 WM14 可用于鉴别区分陆川猪（纯种陆川猪、二元猪、三元猪）与其他品种猪（地方黑猪、地方土猪、白条猪）。引物 WM12 和 WM14 的特异性较强。（二）重现性评价对用 DNA 试剂盒提取的纯种陆川猪、二元猪、三元猪、地方土猪、地方黑猪、白条猪（生鲜肉、熟肉、扣肉、腊肉）DNA 分别作五次 PCR 及电泳的检测，进而评价该引物的重现性 27。重现性结果如表 5 所示。表 5 重现性检测结果样品试验次数WM12(1200 bp)1 2 3 4 5WM14(900 bp)1 2 3 4 5陆川猪生鲜肉 陆川猪熟肉
