1、本站最近研究开发了 ABO 血型全自动微板检测法，并对 2857 名献血者进行 ABO 血型鉴定，一 次判读准确率达到 99.83%。该法的应用大大地降低了实验者的工作强度，避免了人为因素 导致的错判血型，确保了临床输血的安全。笔者着重对该方法的可靠性和干扰因素进行研究 ，结果报告如下。1 材料和方法1.1 材料 2857 份献血者血液标本（2.5mgEDTANa 2/ml 抗凝全血）；Genesis RSP-100 型全自动样本处理 系统，SLT 自动扫描酶标仪及随机购置的支持软件 Soft2000(瑞士TECAN 公司产品)；T.S 温控 孵育振荡仪（奥地利 Anthos 公司）；KUBO
2、TA Ks-5000 平板式离心机（日本久保田公司）；9 6 孔硬质 U 型板（丹麦）；单克隆抗-A、抗-B 血清（长春生物制品研究所）；5% 3 人份 以上混合试剂红细胞（自制）；A 2亚型红细胞（Ortho 公司产品），经盐水洗涤 2 次配成 5 %的盐水悬液。1.2 全自动微板检测法（简称微板法） 用 96 孔 U 型微量反应板，通过全自 动加样器 处理样本和试剂。正定型中，分别加入标准抗血清 30l 和 5%样本红细胞 30l，反定型中， 分 别加入样本血浆 50l 和 5%标准红细胞 30l。经孵育、离心、悬浮和静止，再用自动酶标仪 取 620nm 波长对反应板进行扫描、判读，随后在
3、电脑中进行正反定型结果配对比较，确认无误 后，将最终正确结果经站电脑网络与相应献血者资料存放在一起。经多次正交试验 检测和各参数指标间的对比试验，优化得出 ABO 正反定型检测最终试 验条件为，孵育：3min，500r/min，2level；离心：400g，90s；悬浮：3min，900r/min，3 level；静止：正定型 12min，反定型 56min；判读：620nm 波长，40 点扫描，Tc15%为凝 集反应， Tc10 为非凝集反应，10Tc15 为可疑，需手工法重新鉴定。依据Soft20 00 支持软件结构，微凝板经扫描后每孔都可获得一最小透光率（minimum transmis
4、sion, Tn）和最大透光率(maximum transmission,Tm)，非凝集孔 Tm 与 Tn 的差 值 （contrast transmission,Tc）较小，凝集孔 Tc 值较大；当 Tc 值超过一特定值时，提示细胞 凝集，结果判为阳性；反之，Tc 值较小时表明细胞不凝集，结果判为阴性。根据ABO 正反定 型原则 3 ，确定其血型。1.3 试管法，平板法 见文献3方法。2 结果2.1 方法的可靠性2.1.1 可重复性 取 8 份样本，连续进行 20 次反定型，每次得阳性 Tc 值 9 个，阴性 Tc 值 7 个 ，分别算出它们的平均 Tc 值，然后对 20 份阳性和阴性的平均
5、 Tc 值分别进行数理统计，依次得 标准差(s)为 2.091、0.295 和变异系数(cv)为 2.91%、8.03%，均10%，说明该试验 具有良好的可重复性。2.1.2 稳定性 取 48 份标本，连续进行 3 次正反定型，每次间隔 11 d,显示：正定 型凝集试验中均为 4+，无任何变化;而对反定型凝集试验中的 Tc 值按配对资料的两两比 较进行数理统计，无显著性差别、(t0.387，n=62，经查表，t 0.05 =2.000,故 P0.05)。2.1.3 准确率 通过 2857 份献血者样品的正反定型，得出正反定型 试验 1 次判读准确率 为 99.83%，证明该试验方法完全可靠。异
6、常结果主要出现在反定型中，其中 3 份样本为严重 脂血，2 份为血型抗体极弱。2.1.4 敏感性 将单克隆-抗 A 血型试剂倍比稀释，每种稀释度加样 30 l，再分别加 入 5%A 型和 A2亚型红细胞悬液 30l，按上述 3 种方法进行操作，分别测得其结果（表1） 。 用 B 型血浆代替上述单克隆抗-A，加样量改为 50l，其余不变，分别测得其结果（ 表 2）。表 1 A 和 A2亚型红细胞在 3 种方法中测得单克隆抗-A 效价单抗 A 血型试剂倍比稀释原液 12 14 18 116 132 164 1128 1256 1512 效价A 58.5 67.6 77.2 80.5 82.6 76
7、.7 60 . 2 26.7 17.6 5.8 256微板法A2 58.7 72.4 78.9 79.8 74.2 60.1 51.4 18.0 6.7 3.1 128A 4 4 4 4 4 3 2 128试管法A2 4 4 4 3 3 1 64A 4 4 4 4 3 2 1 128平板法A2 4 4 3 3 3 1 64表 2 分别用 A 和 A2亚型红细胞在 3 种方法中测 B 型血浆中抗-A 效价B 型血浆倍比稀释原液 12 14 18 116 132 164 1128 效价A 75.7 71.4 61.5 37.5 17.5 15.4 7.3 5.5 32微板法A2 71.9 43.4
8、 19.7 15.9 8.8 6.1 4.6 4.4 8A 4 4 3 2 16试管法A2 4 2 1 8A 3 3 2 1 16平板法A2 3 3 2 82.2 干扰因素 主要从溶血、脂血和黄疸对该试验结果的影响程度来研究该试验是否存在假阳性和假阴性情况。将市售血红蛋白、三油酸甘油酯和胆红素用 A 或 B 型血浆配成系列浓度，然后分别吸取 50ml 加入 96 孔 U 型微量板中，每种浓度做 8 孔，作微板法（表35）。 表 3 溶血(血红蛋白)对 TC 值的影响血红蛋白含量(g/L)6 52.5 45 37.5 30 22.5 15 7.5 0无凝集 0.45 0.31 0.71 0.60
9、 1.51 0.79 1.3 5 1.75 3.14凝 集 0.76 1.68 2.83 5.20 7.45 11.2 21.8 31.9 77.9表 4 脂质(三油酸甘油酯)对 Tc 值的影响三油 酸甘油酯含量(mg/L)366 .8 320.95 275.1 229.25 183.4 137.55 91.7 45.85 0 无凝集 1.9 3 2.8 2.91 2.84 3.55 3.74 4.38 4.48 4.96凝 集 4.69 8.69 10.0 12.71 13.9 17.9 41.0 55.9 59.9表 5 黄疸(胆红素)对 Tc 值的影响胆红素含量(mol/L)684 59
10、8.5 513 42 7.5 342 256.5 171 85.5 0无凝集 2.29 2.65 3.03 3.39 2.64 3.14 2.84 2.76 4.05凝 集 68.4 65.8 67.3 65.8 67.0 66.2 62.3 65.0 64.93 讨论全自动微板法具有很好的重复性和稳定性，经 28 57 名献血者 ABO 血型鉴定，一次判读准确率达到 99.83%，与国外文献报道的 98.8%（用 Kemble ，BG15 系统检测） 8 和98.5%（PK7200 分析系统检测） 6 相似。单克隆抗-A 试剂呈兰色，对 620nm 波长有吸收干扰作用，在本实验(表 1) 中
11、得到了证 实。但在对献血者样本用单克隆抗-A 原液进行正定型时，发现凝集试验的 Tc 值全部在 35 以 上，且 Tc 值在 45 以上占 99.82%。针对该方法的 Cut off15 为凝集反应来说，其实际 影响程度并不大，只要保证单克隆抗体的效价在 128 以上且亲和力10s 即可。微板法中测定单克隆抗 -A 效价，不论是用 A 型还是 A2 亚型红细 胞， 都比试管法或平板法高一个滴度，此说明正定型中微板法的灵敏度优于试管、平板法；在反 定型中微板法对 A 细胞的灵敏度优于试管、平板法，而对 A2 亚型 3 种方法无差异(表 1，2)。从表 35 中可见，脂质、溶血对该试验判读有一定的干扰，而胆红质对 该试验没有任何影响。在对 2857 份献血者样本反定型中就发现有 3 份脂血和 2 份弱抗体 样本产生假阴性结果（表 35），故在实际工作中除了尽量避免脂血和溶血样本的发生， 还要保证 5%的3 人份以上混合而成的试剂红细胞悬液的新鲜。如果碰到 ABO 正反定型不符时，应该由经典的常规方法确认，以考虑是否有亚型、 弱抗体和假凝集等因素存在。
