1、中国农业科学 2008,41(8):2454-2459Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.08.034收稿日期：2007-06-21 ；接受日期：2008-02-01基金项目：国家自然科学基金项目（30571384）作者简介：夏炉明（1982-） ，男，江西湖口人，硕士研究生，研究方向预防兽医学。E-mail ：。通讯作者严亚贤（1966-） ，女，江苏启东人，博士，研究方向为微生物学与免疫学。Tel：021-64789734；E-mail：丝裂霉素 C对溶原性大肠杆菌 O157 Stx毒素表达的影响夏炉
2、明 1，2，孙建和 1，严亚贤 1（ 1 上海交通大学农业与生物学院，上海 201101； 2 上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）摘要：【目的】 确定丝裂霉素 C 对溶原性大肠杆菌 O157 中 Stx 前噬菌体和 Stx 毒素的诱导作用。 【方法】利用丝裂霉素 C 作诱导剂对 8 株溶原性大肠杆菌 O157 进行噬菌体诱导 ，以 MC1061 作指示菌采用双层琼脂平板法观察诱导前后的噬菌斑，并采用 PCR 方法对噬菌体进行鉴定。同 时测定 8 株溶原性大肠杆菌 O157 经丝裂霉素 C 诱导前以及诱导 8、12、16 h 这 4 个阶段滤液中 Stx 毒素的表达量，毒素表达量采
3、用 WST-1 细胞毒性检测试剂盒检测 Vero 细 胞存活率。 【结果】溶原性大肠杆菌 O157 经丝裂霉素 C 诱导 后释放大量的 Stx 噬菌体颗粒。同 时诱导后Stx 毒素的表达量也 显著增加，且随着诱导时间的延长毒素的表达量继续 增加，但增加的幅度逐渐减缓。 【结论】本研究确定了丝裂霉素 C 可以诱导溶原性大肠杆菌 O157 释放 Stx 噬菌体，同时也增加了 Stx 毒素的表达，从而增强细菌的毒力。关键词：大肠杆菌 O157；Stx 噬菌体；Stx 毒素；丝裂霉素 C；Vero 细 胞Effect of Mitomycin C on the Expression of Shiga
4、Toxin from Escherichia coli O157XIA Lu-ming1,2, SUN Jian-he1, YAN Ya-xian1(1School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 201101; 2Shanghai Animal Disease Control Center, Shanghai 201103)Abstract: 【Objective】Effect of mitomycin C on the induction of the Stx-converting bac
5、reriophages (Stx phages) and the expression of Shiga toxin (Stx) from Escherichia coli O157 was investigated. 【Method】 Bacteriophage was induced by mitomycin C from 8 strains of Escherichia coli serotype O157 and plaques were screened by two layers agar assy using the Escherichia coli MC1061 as indi
6、cator. PCR was used to identify the Stx phages. The production of Stx toxins which induced from Escherichia coli O157 was simultaneously measured by WST-1 cell proliferation and cytotoxicity assay kit. Toxin expression included four stages (before induction, after induction 8 h, 12 h and 16 h). 【Res
7、ult 】 The results of study showed that mitomycin C induced the release of Stx phages and the expression of Stx toxin from Escherichia coli O157 was apparently increased while induced by mitomycin C. The scope of increase was slower with the time of induction. 【Conclusion】Stx phages release and Stx t
8、oxin expression from Escherichia coli O157 may be increased while induced by mitomycin C. Therefore, the pathogenicity of germs will be enhanced.Key words: Escherichia coli O157; Stx phages; Stx toxin; Mitomycin C; Vero cell0 引言【研究意义】产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）能够引起人和动物的腹泻和
9、出血性结肠炎（Hemorrhagic colitis，HC），大肠杆菌 O157 是 STEC 的主要血清型，大肠杆菌 O157 的感染还可能进展为严重威胁生命的综合征，如溶血性尿毒综合征（Hemolytic-uremic syndrome，HUS）、血栓性血小板减少紫癜（Thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP）等 1。8 期 夏炉明等：丝裂霉素 C 对溶原性大肠杆菌 O157 Stx 毒素表达的影响 2455志贺毒素（Shiga toxin，Stx ）是大肠杆菌 O157 的主要毒力因子之一，它能够引起内皮细胞、肾小管细胞的损伤而导致急性肾功能衰竭（A
10、cute renal failure，ARF） 2。编码志贺毒素的 stx 基因由一组温和噬菌体（Stx 噬菌体）编码，Stx 噬菌体能够溶原转换至宿主菌的染色体中，使得宿主菌获得产生相应毒素的能力，从而增强宿主菌的致病力 3。有鉴于此，对 Stx 噬菌体和 Stx 毒素的诱导特征进行相关研究有助于从一个全新的角度来监测、控制、预防 STEC O157 的感染。【前人研究进展】对于溶原菌中 Stx噬菌体的诱导方法国外学者做了大量的研究。一些刺激因素如紫外线、丝裂霉素 C、低剂量的抗生素、去甲肾上腺素、中性粒细胞、H 2O2 等能够诱导 STEC溶原菌释放 Stx 噬菌体 1,46，但对溶原菌中
11、 Stx 毒素表达影响方面的研究却比较匮乏 4,7,8。【本研究切入点】stx 基因和编码裂解宿主菌细胞膜、细胞壁的裂解基因 S 和 R 均存在噬菌体的晚期操纵子中 7，随着宿主菌的裂解和成熟噬菌体粒子的释放，Stx 毒素的表达量是否也增加以及增加的显著性如何，本研究首先建立检测诱导滤液中 Stx 毒素的方法，从而进一步研究丝裂霉素 C 对 Stx 毒素表达量的影响。 【拟解决的关键问题】建立检测溶原菌诱导滤液中 Stx 毒素的方法，应用该检测方法研究丝裂霉素 C 对诱导溶原性大肠杆菌 O157 Stx 毒素表达量的影响。1 材料与方法1.1 材料8 株大肠杆菌 O157 菌株（PB0308-
12、1、PB0308-2、PB0308-3、 PB0308-4、PB0308-5、PB0308-7、C0308 均分离自上海闵行区某猪场，JS001 为大肠杆菌 O157 参考株，由南京农业大学陆承平教授惠赠），试验菌株大肠杆菌 MC1061、Vero 细胞均由上海交通大学农生院兽医生物技术研究所提供。1.2 方法1.2.1 细菌培养物 滤液提取 从 9 株细菌的平板培养物上挑取单个菌落接种 5 ml LB 液体培养基，每株细菌接种两管，于 37振荡培养至 OD600 约 0.8 左右，取其中一管 4，4 000g 离心 30 min。上清经过 0.22 m 滤器过滤除菌。另外一管 5 ml 转入
13、 20 ml新鲜 LB 液体培养基，加入丝裂霉素 C 至终浓度 0.5 gml-1， 37 150 r/min 继续振荡，分别在诱导8、12 和 16 h 各取 5 ml 4， 4 000g 离心 30 min。上清用 0.22 m 滤器过滤除菌。取滤液划平板以检测滤液中有无细菌，将无菌滤液于20保存备用。1.2.2 噬菌斑的观察 以大肠杆菌 MC1061 作为指示菌，利用双层琼脂平板法（底层平板用 1.5%琼脂，顶层用 0.7%琼脂）检测上述滤液中的噬菌体所形成的噬菌斑。将 1.2.1 中保存的滤液原液作梯度稀释，分别稀释 100、10 -1、10 -2、10 -3、10 -4。取 300
14、l 上述滤液稀释液与 200 l 指示菌混匀，于 37孵育 15 min 后与 45左右已熔化的顶层琼脂混匀，并加入2.5 molL-1 CaCl2 至终浓度 1 molL-1，混合均匀后浇注在底层平板上，室温放置 30 min 后倒置于 37培养箱培养 1012 h 观察噬菌斑。1.2.3 Stx 噬菌体的鉴定 在噬菌斑分布均匀的双层琼脂平板上挑取单个噬菌斑，对该噬菌斑进行 4 次反复纯化。将纯化的噬菌体提取噬菌体 DNA9。根据 Stx 噬菌体（Genbank number：X07865）核酸序列设计引物：Stx2P1（5-TTCTTCGGTATCCTATTCC-3）/Stx2P2 （5-
15、TGACTCTCTTCATTCACGGCG-3）。采用 PCR 的方法对 Stx 噬菌体进行鉴定。PCR 反应体系为 25 l：2Taq PCR MasterMix 12.5 l，Stx2P1 、Stx2P2 引物各 1 l，去离子水 9.5 l，模板 1 l；扩增参数为：94 3 min；94 30 s，58 30 s，72 1 min，35 个循环；最后 72延伸 10 min。PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统观察并记录试验结果。1.2.4 Vero 细胞的复苏和传代培养 10 用 3738的温水融化从液氮中取出的 Vero 细胞冷冻管，融化后低速离心 10 min，
16、去上清液，加新鲜含 10%胎牛血清的 DMEM 培养液培养刚复苏的细胞，置于 37 5% CO2 细胞培养箱中培养 24 h，生长良好的 Vero 细胞用 0.25%胰酶消化液消化 20 min 左右，吸去胰蛋白酶液，加入新鲜 DMEM 培养液进行传代。1.2.5 Vero 细 胞毒性试验 将长成单层的 Vero 包被到 96 孔平底细胞培养板，待 1824 h 细胞长成单层后，接种 10 l 1.2.1 步骤中保存的细菌培养物滤液，同时以 MC1061 培养液的滤液、LB 培养基和含丝裂霉素 C 的 LB 培养基滤液接种 Vero 细胞作对照。将96 孔板置于 37 5% CO2 细胞培养箱
17、中孵育 12 h。按照 WST-1 细胞毒性检测试剂盒说明配制 WST-1 溶液（碧云天生物技术研究所），每孔加入 10 l WST-1 溶液，在细胞培养箱中继续孵育 4 h。将 96 孔平底细胞培养板置于摇床上摇动 1 min，用酶标仪在 450 nm 波长处检测每孔 OD 值。2456 中 国 农 业 科 学 41卷1.2.6 结果分析 细胞的存活率：细胞的存活率以T/C%表示，T 为各检测孔的 OD 值减去本底 OD 值（其中本底 1 为细胞培养基+LB 液体培养基+WST-1，无细胞；本底 2 为细胞培养基丝裂霉素 C 浓度为 0.5 gml-1 LB 液体培养基+WST-1，无细胞。
18、）各重复孔的 OD 值取均数。C 为对照细胞各孔 OD 值减去本底 OD 值（对照细胞 1 为 LB 液体培养基刺激细胞的 OD 值；对照细胞 2 为丝裂霉素 C 浓度为 0.5 gml-1 LB 液体培养基刺激细胞的 OD 值）。丝裂霉素 C 诱导前的细胞存活率% =（诱导前各检测孔 OD值本底 1 OD 值）/（对照细胞 1 OD本底 1 OD值）100 ；丝裂霉素 C 诱导后的细胞存活率%=（诱导后各检测孔 OD 值本底 2 OD 值）/（对照细胞 2 OD本底 2 OD 值）100。2 结果与分析2.1 噬菌斑形态观察未经过丝裂霉素 C 诱导的细菌培养物的滤液观察不到噬菌斑，整块平皿表
19、现为模糊、不透明，表明没有噬菌体释放。用丝裂霉素 C 作诱导剂诱导后的细菌培养物的滤液，未稀释时在双层琼脂平板上观察不到噬菌斑，整块平皿表现透明。滤液作 10-1 稀释时，可以看到大量的噬菌斑连成一片。滤液稀释 10-2 和10-3 培养 810 h，能观察到单个噬菌斑，噬菌斑小而混浊，整块平皿呈磨玻璃样，边缘稍整齐，噬菌斑直径在 0.50.8 mm。2.2 Stx噬菌体的鉴定 提取纯化噬菌体的 DNA，经 PCR 的检测，电泳后可以清晰地看到一条特异性的条带，大小均与 789 bp 相符（图 1） 。 结 果 显 示 8 株 O157 菌 株 经 丝 裂 霉M： D2000 DNA mark
20、er；1：PB0308-5；2：PB0308-1；3：PB0308-2；4：PB0308-7；5：PB0308-3；6：C0308；7：JS001；8：PB0308-4.图 1 Stx噬菌体 A亚单位 PCR产物Fig. 1 The result of PCR for Stx bacteriophage A subunit素 C 诱导后释放的噬菌体均为 Stx 噬菌体，根据噬菌体的宿主菌来源分别将其命名为：PB0308-5、PB0308-1、PB0308-2 、PB0308-7、PB0308-3、C0308 、JS001、PB0308-4 。2.3 Vero细胞形态观察在 100 倍倒置显微镜
21、下观察到正常 Vero 细胞形态为长梭状，如图 2 所示。接种细菌滤液后，可以明显地见到细胞发生病变，细胞皱缩、变圆、逐渐脱落。如图 3 所示。图 2 细菌滤液接种前正常 Vero细胞Fig. 2 Normal Vero cells before inoculating bacterial filtrate图 3 接种细菌滤液后病变 Vero细胞Fig. 3 The cytopathic effect of Vero cells after inoculating bacterial filtrate2.4 细胞毒性比较丝裂霉素 C 对大肠杆菌 O157 中 Stx 毒素的诱导分为诱导前、诱导
22、 8 h、诱导 12 h 以及诱导 16 h 等 4个阶段，其诱导效果通过利用 WST-1 细胞毒性检测试剂盒检测 Vero 细胞的存活率进行评估，其中MC1061 作为阴性对照组，JS001 作为阳性对照组。8 期 夏炉明等：丝裂霉素 C 对溶原性大肠杆菌 O157 Stx 毒素表达的影响 2457细胞的存活率如表 1 所示。对 7 株试验菌株及阴阳性对照菌株 4 个阶段 Vero 细胞存活率利用 SPSS 软件进行配对 T 检验。检验结果显示 7 株试验菌株各阶段之间细胞存活率的差异极显著（P0.01），不仅诱导前后细胞存活率差异极显著，而且诱导 8、12和 16 h 之间细胞存活率差异也
23、极显著。随着诱导时间的延长毒素的表达量增加，但增加的幅度逐渐减缓。阳性对照组诱导前后及诱导后 8、12 和 16 h 各阶段之间 Vero 细胞存活率差异极显著（P0.01），阴性对照组间各阶段则差异不显著（P0.05）。各阶段之间细胞存活率的变化幅度及各菌株之间细胞存活率比较如图 4 和图 5 所示，研究表明丝裂霉素 C 在诱导溶原性大肠杆菌 O157 释放 Stx 噬菌体的同时也诱导了 Stx 毒素的表达。表 1 丝裂霉素 C诱导各阶段细胞毒性比较（细胞存活率%）Table 1 Comparison of cytotoxicity without and with mitomytin C
24、induced (Survival rate, %)诱导后 After induction菌株Bacteria诱导前Before induction 8 h 12 h 16 hPB0308-1 75.73 52.60 40.28 36.35PB0308-2 85.19 47.48 42.08 39.33PB0308-3 80.16 45.12 33.99 30.22PB0308-4 78.16 51.70 46.58 35.28PB0308-5 75.79 53.78 47.37 39.10PB0308-7 80.16 43.04 40.45 34.10C0308 80.58 53.27 47
25、.20 43.15JS001 81.92 49.06 45.96 40.73MC1061 81.07 79.46 79.97 76.16图 4 不同阶段细胞存活率平均值变化幅度Fig. 4 Comparison of average rate of cell survival among the four stages3 讨论志贺毒素（Stx）又称为 Vero 毒素，1977 年Konowalchuk 首先发现某些大肠杆菌的培养滤液中有1. PB0308-1；2. PB0308-2；3. PB0308-3；4. PB0308-4；5. PB0308-5；6.PB0308-7；7. C0308
26、；8. JS001；9. MC1061图 5 各菌株间同一阶段细胞存活率比较Fig. 5 Comparison of cytotoxicity at the same stage among different strains一种能引起 Vero 细胞产生细胞病变的效应物质，被称作 Vero 毒素 7,11。目前 Vero 毒素的检测方法是在采用 PCR 技术检测到 stx 基因的基础上，再采用Vero 细胞培养方法进行检测，主要观察细胞病变，但这种方法的缺点是只能定性而不能定量，而且受试验操作者主观判断误差的影响，且操作相对繁琐。此外有采用 ELISA 检测 Stx 的报道，但国内暂无相关商
27、品化的试剂盒。WST-1 是一种类似于噻唑蓝（MTT）的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan，细胞增殖越快，则表明代谢越旺盛，检测孔显示的颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，颜色的差异可以通过测定波长 450nm 处的光密度值进行分析。因此，WST-1 细胞毒性检测试剂盒既可以定性又可以定量，而且还可以克服人的主观误差，从而提高了试验的准确性。此前也有人采用 MTT 法检测细胞毒性 12，而 WST-1 与 MTT 相比具有明显的优点，MTT 被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的2458 中 国 农 业 科 学 41卷formazan 不是
28、水溶性的，需要特定的溶液来溶解，而WST-1 产生的 formazan 是水溶性的 13。因此 WST-1试剂盒简化了实验步骤，使试验结果更稳定，灵敏度更高。本研究选择丝裂霉素 C 作为诱导剂比较大肠杆菌 O157 滤液中诱导前后及不同阶段毒素量的原因，是因为丝裂霉素 C 经常用作噬菌体诱导的刺激物，有研究表明终浓度 0.5gml-1 丝裂霉素 C 能够有效地诱导被 Stx 噬菌体溶原转换的 STEC 菌株释放大量的噬菌 体 14,15。诱导的结果是宿主菌的裂解和成熟病毒颗粒的释放，这些病毒粒子又能感染和溶原转换环境中的大肠杆菌，导致细菌毒力增强，这种感染过程在体内试验中同样可以发生 16。本
29、研究不仅证实了大肠杆菌 O157 菌株经丝裂霉素 C 诱导后，释放大量Stx 噬菌体，同时还诱导了 Stx 毒素的表达。一般认为这与噬菌体 DNA 损伤过程中的 SOS 修复途径有关，这个假设被 RecA 蛋白参与激活 DNA 损伤的 SOS 修复以及诱导 Stx 毒素释放证明 4。在本试验中设置了阴、阳性对照组，MC1061 基因组不含 stx 基因，虽经丝裂霉素 C 诱导细菌细胞仍不能分泌 Stx 毒素，JS001 为大肠杆菌 O157 参考株，其细菌基因组中包含 Stx 前噬菌体，经丝裂霉素 C 诱导后释放大量的Stx 噬菌体和表达 Stx 毒素。这也解释了阴、阳性对照组在丝裂霉素 C
30、诱导后 Vero 细胞存活率存在明显差异的原因，其余 7 株 O157 试验菌株均呈现与阳性对照组同样的规律性。丝裂霉素 C 是一种广谱抗肿瘤抗生素，对多种癌症有抗癌作用，它不同于一般的抗生素 17。研究表明一些低剂量的抗生素也能够诱导含有 stx 基因的溶源菌释放 Stx 噬菌体和分泌志贺毒素。如甲氧苄氨嘧啶、环丙沙星、喹乙醇和卡巴多司等 1,6,18，所以现在对应用抗生素治疗 STEC 感染有很大的争议。最近 Wong19的研究更是表明在对儿童用抗生素治疗STEC 感染时，增加了疾病进展为溶血性尿毒综合征（HUS）的危险。应用抗生素治疗 STEC 感染时不但没有起到治疗效果，反而加重了 S
31、TEC 感染的进展。由于 Stx 毒素是 STEC 主要的毒力因子，毒素表达量增加势必会导致致病作用的增强，因此应用抗生素控制 STEC 感染必须慎重考虑，以免适得其反。4 结论利用 WST-1 细胞毒性检测试剂盒检测 Vero 细胞的存活率评估滤液中 Stx 毒素表达量即可定性又可定量，而且简化了试验步骤，使实验结果更可靠。研究表明，丝裂霉素 C 不仅能够诱导大肠杆菌O157 溶源菌释放 Stx 噬菌体，同时也能够诱导 Stx毒素的分泌，从而增强细菌的毒力。通过检测诱导前后滤液对 Vero 细胞的毒性发现不仅诱导前后 Vero 细胞存活率差异极显著，而且诱导后 8、12 和 16 h 各个阶
32、段之间细胞存活率差异也极显著。表明诱导后Stx 毒素的表达量显著增加，且随着诱导时间的延长毒素的表达量增加，但增加的幅度趋缓。References1 Sylvia H, Helge K, Herbert S. Shiga toxin-encoding bacteriophages- genomes in motion. International Journal of Medical Microbiology, 2004, 294: 115-121.2 Gro S J, Chloe E J, Heather E A, Darren L S, Jon R S, Alan J M. Surviva
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