1、 申请代码 ： 受理部 门： 收件日 期： 受理编 号： 检查保护国家自 然科 学基金 申 请 书 资助类别 ： 亚类说明 ： 附注说明 ： 项目名称 ： 申 请 者： 电话： 依托单位 ： 通讯地址 ： 邮政编 码： 单位电 话： 电子邮件 ： 申报日期 ： 2006 年3 月8 日 国家自然科学基金委员会 您现在不能检查 保 护文档或打印文 档 ，请根据以下三 个 步骤操作： 1) 如果您是 Word2000 或以上版本用户 ，请把 Word 宏的安全性设为:“ 中“ 方法: Word 菜单- 工具- 宏- 安全性- 安全级, 设置为“ 中“ ( 如果您是 Word97 用户，继续 执行
2、以下步骤) 2) 关闭本文档，重 新打开本文档 3) 点击“ 启用宏“ 按钮，即可开始填 写 本文档或打印了 国家自然科学基 金申请书 第 2 页 版本 1.000.000 基本 信息 申 请 者 信 息 姓名 张靓性别 女 出生 年月 1976 年 2 月 民族 汉族 学位 博士 职称 讲师 主 要研究 领域 心血管 活性 肽的 心脏 保护机 制研 究 电话 010-82802183 电子邮 件 传真 个人网页 工作单位 北京大 学 / 基 础医 学院 在研项目批准号 依 托 单 位 信 息 名称 北京大学代 码 10087101 联系人 马信 电子邮 件 电话 010-62751449
3、 网站地 址 http:/ 合 作 单 位 信 息 单 位 名 称 代 码 在此录入修改 在此录入修改项 目 基 本 信 息 项目名 称 松弛素（r e l a x i n ）抗心肌纤维化的机制研究资助类 别 面上项 目 亚类说明 青年科 学基 金项 目 附注说 明 申请代码 C030204:病理 生理 学 C010701:循环 生理 学 基地类 别 预计研 究年 限 2007 年1 月 2009 年12 月 研究属 性 基础研 究 摘 要 (限 400 字) ：心 肌纤 维化 是导致 心功 能不 全、 心律 失常及 慢性 心衰 难以 逆转 的最主 要病 理 损伤之 一。 本项 目在 我们 前
4、期工 作观 察到 调节 肽松 弛素 （ rela xin） 能有 效抑 制心肌 纤维 化 的基 础上，拟于 在体和离体大 鼠心肌纤维 化模型上，观 察内源 性 r elax in1/3 及其 受体 LGR7 的 表达 和功 能的 变化； 以纤 维母 细胞 的增 殖与表 型 转变 和心 肌胶 原代 谢的 MMPs/TIMPs 系 统的 表达 及活 性变 化为主 要指 标， 观察 re laxi n 处 理对 心肌 纤维 化发 展的影 响； 观察 relaxi n 对心 肌 内源性 促纤 维化 系统 血 管紧 张素/ 醛固酮 系统 的拮抗 作用 及其 作用 机 制 ， 以论证 re laxi n
5、是机 体抗纤 维化 的重 要内 源性 防御因 子的 假说 ，探 讨其 抗心肌 纤维 化 的细胞 分子 机制 ，以 期探 寻心肌 纤维 化发 病的 新机 制和防 治的 新策 略。 关 键 词( 用分号分开，最多5 个) 松弛素 ；心 肌纤 维化 ；肾 素血 管紧 张素 醛 固酮 系统 国家自然科学基 金申请书 第 3 页 版本 1.000.000 项目组主要成员（注: 项目 组主 要成 员不 包括 项目申 请者 ，国 家杰 出青 年科学 基金 类项 目不 填写 此栏。 ） 编号 姓 名 出生年 月 性别 职 称 学 位 单位名 称 电话 电子邮 件 项目分工 每年工 作时间 （月） 1 耿彬19
6、73-6-14 男 讲师 硕士 北京大 学 010-8280285 1 分子生物学 及放免 测定 10 2 潘春水1976-3-19 女 博士生 硕士 北京大 学 010-8280285 1 chunshuipan2002163.c om 分子生物学 及病理 染色 8 3 肖洋1982-10-10 男 博士生 学士 北京大 学 010-8280285 1 放免检测及 生化检 测 6 4 赵晶1980-11-4 女 技术员 其他 北京大 学 010-8280285 1 细胞培 养 10 5 庞永政1945-5-23 男 主管技 师 其他 北京大 学 010-6655112 2 2374
7、实验技术指 导 6 6 在此录入修改7 在此录入修改8 在此录入修改9 在此录入修改总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 0 说明: 高级 、中 级、 初 级、博 士后 、博 士生 、硕 士生人 员数 由申 请者 负责 填报（ 含申 请者 ） ， 总人 数 自动生 成。 国家自然科学基 金申请书 第 4 页 版本 1.000.000 经费申 请表 （金额单 位：万元） 科目 申请经 费 备注（ 计算 依据 与说 明） 一. 研究 经费 23.0000 1.科 研业 务费 9.0000 （1）测 试/ 计算/分析 费 5.0000 生化指标和分子生物学指标测定 （2）能 源/ 动 力
8、费 1.0000 （3）会 议费/差旅 费 1.0000 会议注册和差旅费 （4）出 版物/文献/ 信 息传播 费 2.0000 论文发表、文献检索和复印 （5）其 它 2.实 验材 料费 14.0000 （1）原 材料/试剂/ 药 品购置 费 13.0000 购买活性肽、分子生物学和生化试剂 （2）其 它 1.0000 动物实验 3.仪 器设 备费 0.0000 （1）购 置 （2）试 制 4.实验 室改 装费 5.协 作费 二. 国际 合作 与交流 费 1.0000 1.项 目组 成员 出国 合作 交流 1.0000 参加国际会议 2.境外 专家 来华 合作 交流 三.劳 务费 4.5 研
9、究生劳务费 四.管 理费 1.5000 合 计 30.0000 与本项 目相 关的 其他经 费来源 国家其 他计 划资 助经 费 其他经 费资 助（ 含部 门匹 配） 其他经 费来源 合计 0.0000 国家自然科学基 金申请书 第 5 页 版本 1.000.000 查看报告正文撰写提纲报告正文( 一) 立项依据与 研 究内容 1 项目的立项 依 据 心肌纤维化是指在心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚、 心脏组织中胶原浓度 显著升高或胶原成分发生改变。 这种病理变化在多种心血管疾病中存在， 现认为其与心 律失常、 心功能障碍甚至心脏性猝死密切相关。 心肌纤维化是一种连续变化的过程， 根 据有
10、无心肌细胞缺失、 坏死和瘢痕形成可分为反应性纤维化和修复性纤维化， 前者根据 病变特 点又 分为 间质纤 维化和 血管 周围 纤维化 ，引起 心脏 结构 重塑（remodling） ，并由 此引起舒张、 收缩功能不全， 最终导致心力衰竭； 后者主要表现为心肌细胞坏死和瘢痕 形成， 并可有心脏功能的异常。 基于心肌纤维化已成为慢性心功能不全难以逆转的原因 之一， 常导致严重的后果， 因此研究切实有效的防治措施受到高度关注。 心肌纤维化是 胶原合成代谢和降解代谢失衡的结果， 如心衰时心肌细胞及心肌间质细胞的丢失、 心肌 成纤维细胞活化包括增殖及表型转变、 心肌成纤维细胞合成和分泌的胶原蛋白成分改变
11、 引起的 I 型和 III 型胶原 含量的比值变化等因素， 均促进了心肌胶原的大量沉积， 再加上 促胶原蛋白降解的基质金属蛋白酶的表达和活性下降， 共同作用导致胶原的合成大大增 加而降解大大降低， 导致心肌纤维化的发生。 心肌纤维化的形成机制非常复杂， 长期的 压力过负荷、 炎症反应、 氧化应激等都参与了心肌纤维化的形成， 而上述刺激因素均会 引起内源性的心脏旁/ 自分泌系统的调控紊乱， 其中研究较清楚的包括内源性的肾素血 管紧张素醛固酮系统 （renin-angiotensin-aldosteron system, RAAS）、内 皮 素（ endothelin， ET） 一氧化氮 （nit
12、ric oxide ， NO） 系统、 血小 板衍生的生长因子 （platelet derived growth factor, PDGF ）血栓 素 2（thromboxane, TxA 2 ）系统等，心脏的这些旁/ 自分泌系统不 仅诱导心肌损伤， 也是心肌纤维化的促进因子， 但至今为止内源性的抗心肌纤维化防御 体系则研究甚少，作用尚不清楚，近年来引起了高度关注。 近年来研究发现一种古老的多肽， 松弛素， 是迄今发现的最强的内源性抗纤维化物 质之一， 是最具前景的内源性抗纤维化物质。 松弛素 （relaxin ， RLX）是 1926 年， Hisaw 从怀孕的猪黄体细胞中提取的妊娠相关激素
13、，能松弛耻骨韧带、软化宫颈，促进分娩。 Relaxin 是胰岛素样生 长因子超家族的一员， 在人及其他一些高等灵长动物体内有 3 种类 型，分别为 H1 ，H2 ，H3 ，其中 H2 是组织储存及血液循环中存在的主要形式；在啮齿 国家自然科学基 金申请书 第 6 页 版本 1.000.000 动物存在两种 RLX 类 型， 分别为 RLX-1 （相 当于 H2）和 RLX-3 （ 相当于 H3 ） 。 后来研 究发现，在非妊娠期的妇女及男性体内多种组织都有 relaxin 的表达，推测 relaxin 不仅 是一种生殖激素，可能还具有多种生物学效应。但直至 2000 年，人们利用同源分析的 方
14、法发现并克隆了孤儿受体 LGR7 （leucine rich repeat containing, G protein coupled receptors, LGR ） ，随后 证实 RLX 为其内源性 配体，这一发现使 relaxin 的功能研究进入 了一个崭新的阶段， 就此 2002 年，Science 杂 志就曾发表社评文章， 指出对 relaxin 功能 的重新认识有着深远的影 响 。Relaxin 是体内 广泛分布的多功能活 性 多肽，不仅调节生 殖系统功能， 还参与神经垂体激素的分泌、 大脑发育和心血管系统功能稳态等广泛生理 过程的调节，在肿瘤的发展和转移及其心血管疾病发病中均具有
15、重要的病理生理意义， 其中 relaxin 强大的抗纤维化效应尤为受人关注。 在 relaxin 基因敲除的小鼠及其受体 LGR7 基因敲除的小鼠全身各脏器均出现严重的 纤维化， 早期补充使用 relaxin 可阻止肺纤维化、 肺泡实质化、 支气管 上皮肥厚等病理变 化发生； 在溴化乙胺诱导的小鼠出现肾脏间质纤维化、 肾小球滤过率下降及蛋白尿， 补 充 relaxin 有效的抑制了间质纤维化， 改善肾功能。 在肝脏，relaxin 同 样减弱了 I 型胶原 的合成。既往的研究认为在心肌细胞 relaxin 及其受体的表达很低，心肌局部旁/ 自分泌 的 relaxin 在心肌纤维 化中的作用不被
16、关注。2005 年，我们课题组首先在国外杂志上报 道了 relaxin 对心血管疾病的保护作用：在亚急性异丙肾上腺素（isoproterenol, ISO ） (Peptides ，2005 Sep；26 ：1632-1639) 诱导的大 鼠心肌坏死、 纤维化的模型上， 心脏内源 性的 relaxin 表达、 合成 显著增加， 外源性给予 relaxin 可以明显改善心功能， 减轻心肌 缺血损伤， 抑制心肌纤维化， 据此我们认为 relaxin 是一种内源性的心 脏保护物质。 我们 的工作虽然发表时间不长， 但已受到了学术届的高度关注， 当年即被 SCI 文献引用。 但 relaxin 的抗心
17、肌纤维化的机制远未阐明。 目前研究认为 relaxin 可能是通过下列途径发挥作用的：1、relaxin 能显著的抑制纤 维母细胞的增殖；2、relaxin 抑制胶原的合成、 分泌及在组织中的沉积；3、relaxin 抑制 纤维形成过程中其他基质成份的表达上调， 如纤维结合蛋白、 弹性蛋白纤维、 原纤维蛋 白2 及氨基葡聚糖等；4、relaxin 刺激多种基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP ）的表达和活性 ，抑制金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMPs) 的表达和活性。 但在不同的种
18、属、不同的组织器官、不同病因诱导的纤维化中， relaxin 抗纤维化的作用及机制均不相同。 与其他组织器官的纤维化的发病不同， 心肌纤 国家自然科学基 金申请书 第 7 页 版本 1.000.000 维化的发生与其自身的旁/ 自分泌活性物质 AngII 、 醛固酮的功能紊乱 关系更为密切， 在 多种因素诱导的心肌纤维化中都伴随心肌 AngII 、 醛固酮基因表达和活 性的增强。 Relaxin 是一种心血管活性物质，心肌能合成和分泌 relaxin 1、relaxin 3， 并且在心室和心房 均富含 LGR7 受体。有 文献报道在中枢系统，relaxin 抑制 AngII 的表 达，参与中
19、枢 渗 透 压的调节，但内源性的 relaxin 对心肌旁/ 自 分泌的 AngII 及 醛固酮 有何影响及相应的作 用靶点尚未见报道。 我们的假说是 relaxin 可能通过作 用于心脏旁/ 自分泌的 AngII 及醛 固酮系统 ，拮抗心肌纤维化，是 机体抗纤维化的内源性 防御体系。 本项目拟 于在体和离体大鼠心肌 纤维化模型上，观察内 源性 relaxin1/3 及其 受 体 LGR7 的表达和功能的变化；以纤维母细胞的增殖与表型转变和心肌胶原代谢的 MMPs/TIMPs 系统的表达及活性 变化为主要指标，观察 rel axin 处理对心肌 纤维化发展 的影响； 观察 relaxin 对心
20、肌内源性 促纤维化系统 血管紧张素/醛固酮 系统的拮抗 作用及其 作用机制， 以论证 re laxin 是机体抗纤维化的 重要内源性防御因子的 假说， 探 讨其 抗心肌纤维化的细胞分子机制，以期探寻心肌纤维化发病的新机制和防治的新策 略。 参考文献 ： 1 Hisaw FL: Experimental relaxation of the pubic ligament of the guinea pig. Proc Soc Exp Biol Med 1926, 23:661-663. 2 Samuel CS. Relaxin: antifibrotic properties and effect
21、s in models of disease. Clin Med Res. 2005 Nov;3(4):241-9. 3 Samuel CS, Zhao C, Bathgate RA, Du XJ, Summers RJ, Amento EP, Walker LL, Mc Burnie M, Zhao L, Tregear GW. The relaxin gene-knockout mouse: a model of progressive fibrosis.Ann N Y Acad Sci. 2005 May;1041:173-81. 4 Sherwood OD. Relaxins phys
22、iological roles and other diverse actions. Endocr Rev. 2004 Apr;25(2):205-34. 5 Bennett RG , Kharbanda KK, Tuma DJ. Inhibition of markers of hepatic stellate cell activation by the hormone relaxin. Biochem Pharmacol. 2003 Sep 1;66(5):867-74. 6 Zhang J, Qi YF, Geng B, Pan CS, Zhao J, Chen L, Yang J,
23、Chang JK, Tang CS. Effect of relaxin on myocardial ischemia injury induced by isoproterenol. Peptides. 2005 Sep; 26(9):1632-9. 7. Lekgabe ED, Kiriazis H, Zhao C, Xu Q, Moore XL, Su Y , Bathgate RA, Du XJ, Samuel CS. Relaxin reverses cardiac and renal fibrosis in spontaneously hypertensive rats.Hyper
24、tension. 2005 国家自然科学基 金申请书 第 8 页 版本 1.000.000 Aug;46(2):412-8. 8. Mookerjee I, Tang ML, Solly N, Tregear GW, Samuel CS. Investigating the role of relaxin in the regulation of airway fibrosis in animal models of acute and chronic allergic airway disease. Ann N Y Acad Sci. 2005 May;1041:194-6. 9. Benn
25、ett RG, Mahan KJ, Gentry-Nielsen MJ, Tuma DJ. Relaxin receptor expression in hepatic stellate cells and in cirrhotic rat liver tissue. Ann N Y Acad Sci. 2005 May;1041:185-9. 10. Richard Ivell. This hormone has been relaxin too long. Science 2002; 295: 637-638. 2 项目的 研究内容 、研究目标及拟 解 决的关键问题 研究目标 ： 本项目拟
26、于在体和离体大鼠心肌纤维化模型上，观察内源性relaxin 1/3 及其受体LGR7 的 表达和功能的变化；以 纤维母细胞的增殖与表 型转变和心肌胶原 代谢的MMPs/TIMPs 系统的表达及活性变化为主要指标，观察relaxin 处理对心肌纤维化 发展的影响； 观察relaxin对心肌内源性促纤维化系统血管紧张素/醛固酮系统的拮 抗作用及其作用机制， 以论证 relaxin 是机体 抗纤维化的重要内源性 防御因子的假说， 探讨其抗心肌纤维化的细胞分子机制， 以期探寻心肌纤维化发病的新机制和防治的新策 略。 研究内容： 1、以 ISO 诱导的大鼠 亚急性心衰及腹主动脉 结扎诱导的大鼠慢性心 衰
27、分别作为修 复性心肌纤维化和反应性心肌纤维化的模型，分别观察心脏内源性的 relaxin 1/3 的 mRNA 表达和放免活性、 LGR7 的 mRNA 和蛋白表达及受体亲和力的变化； 观察分别外 源性的给予 relaxin 1 或 relaxin 3 后，对心肌血管紧张素 II、醛固酮表达和活性 、 对 它们的受体表达和亲和力的影响 ；及 心肌羟脯氨酸含量、 I 型及 III 型 胶原蛋白的 mRNA 及蛋白表达、基质成分如纤维结合蛋白、弹性蛋白纤维、原纤维蛋白2 及氨基葡聚糖 等的表达、心肌 MMP-1、2、9、13、TIMPs-1 的 mRNA 及蛋白表达 及活性的变化，以 确定 rel
28、axin 的抗心肌纤维化作用，并筛选其作用的靶分子。 2、在上述工作的基础 上，分别以血管紧张 素 II、醛固酮处理原 代培养的乳鼠心肌 成纤维细胞， 观察心肌细胞 relaxin 1/3 的 mRNA 表达和放免活性、LGR7 的 mRNA 和 蛋白表达及受体亲和力的变化；观察分别予以 relaxin 1 或 relaxin 3 预处理及心肌成 国家自然科学基 金申请书 第 9 页 版本 1.000.000 纤维细胞转染表达 relaxin 的腺病毒，内源性 的高表达 relaxin 后，心肌成纤维细胞的增 殖及上述整体试验中初步确定的靶分子的表达和活性的变化， 及血管紧张素 II 受体和醛
29、 固酮受体的表达和亲和力的改变， 进一步确定 relaxin 的抗心肌纤维化作用及其作用的靶 分子。 3、为了进一步阐明 relaxin 为抗纤维化的内源 性防御体系，在血管紧张素 II 处理原 代培养的乳鼠心肌成纤维细胞， 观察 relaxin 预处理后，AngII 诱导心 肌纤维化发生的分 子信号如 MAPK/ERK、 原癌基因 C-fos 、 活素蛋 白 AP-1、 转化生长因子 TGF 的 mRNA 和蛋白表达及活性的变化； 在醛固酮处理原代 培养的乳鼠心肌成纤维细胞， 观察 relaxin 预处理后，醛固酮诱导心肌纤维化发生的分子信号如血管紧张素受体 I （AT1）、 AP-1、 核
30、转录因子 NF- B 、 碱性成纤维细胞生长因子 bFGF 的 mRNA 和蛋 白表达及活性的变 化，确定 relaxin 抑制 RAAS 诱导心肌纤维化的分子靶点。 4、 在上述研究的基础上， 进一步观察 relaxin 抑制心肌纤维化的细胞内信号转导机 制。在原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，分别利用腺苷酸环化酶（adenyl cyclase,AC）、 PKA、 过酪氨酸激酶 （tyrosine kinase, TK ） 、 磷 酸二酯酶 （phosphodiesterase, PDE）、 Erk1/2 及 PI3K/Akt 的激动剂 和拮抗剂，以上述试验中确定的靶分子的表达和活性的变化为指
31、标，确定 relaxin 抑制心肌纤维化的信号转导机制。 拟解决的关键问 题 ： 确证 Relaxin 为机体抗 纤维化的内源性防御体系，探讨 relaxin 抗 心肌 纤 维 化的机制 及分子信号转导通路。 （1） 在整体、 离体的纤 维化模型上， 观察内源性 relaxin 及其受体 的变化，及外源性补充 relaxin 的抗心肌纤维化效应。 （2）确定 relaxin 抗心肌纤维化的 作用靶点及相应的信号通路。 （3）确 定 relaxin 对心肌 RAAS 系统的影响及其抑制 RAAS 作用的分子靶点。 3 拟采取的研究方 案及可行性分析 拟采取的研究方 案 1、确定 relaxin
32、的抗心肌纤维化作用，筛选其作用的靶分子。 大鼠腹腔注射 ISO 诱导 大鼠亚急性心衰，大鼠腹主动脉结扎诱导的大鼠慢性心衰， 分别复制修复性心肌纤维化和反应性心肌纤维化的模型。 通过组织切片、 天狼星红染色 国家自然科学基 金申请书 第 10 页 版本 1.000.000 观察心肌纤维化， 利用生化方法测定心肌羟脯氨酸含量。 采用 Real-Time PCR 或 Northern Blot 方法检测心肌 relaxin 及其受体 LGR7 的 mRNA 表达；采用放射免疫方法测定心肌 组织 relaxin 的放免活性， 用同位素标记的 relaxin 进行受体 Binding 实 验， 测定 L
33、GR7 受 体的亲和力。 利用免疫组化及 Western Blotd 方 法检测平滑肌 actin （-SMA）的 表 达和组织分布；利用 Real-Time PCR 、Western Blot 的方法测定 I 型及 III 型 胶原蛋白的 mRNA 及蛋白表达、基质成分如纤维结合蛋白、弹性蛋白纤维、原纤维蛋白2 及氨基 葡聚糖等的表达、心肌 MMP-1、2、9、13、TIMPs-1 的 mRNA 及蛋白表达，利用放射 性同位素 109 Cd 测定 MMPs 酶的活性。采用 Real-Time PCR 或 Northern Blot 方法检测心 肌 AngII 、 醛固酮及其 受体的 mRNA
34、 表达；采用放射免疫方法测定心肌组织 AngII 、醛 固酮的放免活性，用受体 Binding 实验，测 定 AngII 、 醛固酮受体 的亲和力。上述测定 方法本课题组均熟练掌握。 2、确定 relaxin 的抗心肌纤维化作用及其作用的靶分子。 分别以血管紧张素II、 醛固酮处理的原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞为心肌纤维化 模型， 采用 3 H-胸腺嘧啶 （TdR） 入测定心肌成纤维细胞的增殖， 免疫组化及 Western Blotd 方法检测平滑肌 actin （-SMA ）的表达和细胞定位说明成纤维细胞表型的改变， 天狼星红染色观察心肌成纤维细胞胶原含量。采用 Real-Time PCR
35、或 Northern Blot 方法 检测心肌 relaxin 及其受体 LGR7 的 mRNA 表达 ； 采用放射免疫方法测定心肌组织 relaxin 的放免活性， 用同位素标记的 relaxin 进行受体 Binding 实验 ， 测定 LGR7 受体的亲和力。 构建 relaxin 表达质粒， 进行重组腺病毒的包装、 克隆化、 扩增、 纯化 和滴定测定后， 转 染乳鼠心肌细胞， 造成 relaxin 高表达。 利用 Real-Time PCR 、 Western Blot 的方法测定以 确定的靶分子 mRNA 及蛋白表达，利用放射性同位素 109 Cd 测定酶的活性。采用 Real-Ti
36、me PCR 或 Northern Blot 方法检测细胞 AngII 、醛固酮受体 的 mRNA 表达，用受 体 Binding 实验，测 定 AngII 、 醛固酮受体 的亲和力。上述测定方法本课题组均熟练掌 握。 3、确定 relaxin 抑制 RAAS 诱导心肌纤维化的分子靶点。 在 AngII 诱导的心肌纤维化组，利用 Real-Time PCR 、Western Blot 的方法测定 MAPK/ERK、原癌基因 C-fos 、活素蛋白 AP-1、转化生长因子 TGF 的 mRNA 和蛋 白表达， 以同位素 32 P 标记的ATP ， 放免测定或磷酸化的 MAPK 抗体进行 West
37、ern Blot 测定 MAPK 的活性，观察 relaxin 作用的分子靶点；在醛固酮诱导的心肌纤维化组，利 国家自然科学基 金申请书 第 11 页 版本 1.000.000 用 Real-Time PCR 、Western Blot 的方法测定 AT1 、AP-1、NF- B 、bFGF 的 mRNA 和蛋 白表达， 并利用荧光染色共定位的方法测定 NF- B 的转位， 观察 relaxin 作用的分子靶 点。上述测定方法本课题组均熟练掌握。 4、确定 relaxin 抑制心肌纤维化的信号转导机制。 根据以上研究，以 relaxin 作用的主要信号转导通路为切入点，如腺苷酸环化酶 （ade
38、nyl cyclase,AC）、 PKA 、过酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK ） 、磷酸二酯酶 （phosphodiesterase, PDE）、 Erk1/2 及 PI3K/Akt ，利用工具药（阻断剂和激动剂） ，并且 直接采用酶学方法测定酶活性及 Western Blot 方法观察其表达、活化（磷酸化或去磷酸 化） ，深入研究 relaxin 作用的信号转导机制。上述测定方法本课题组均熟练掌握。 可行性分析 Relaxin 是迄今发现 的 最强的抗纤维化物质之 一，对多种脏器如肝、 肺、肾及皮肤 的纤维化均有强大的抑制作用。 本课题组的前期工作提示 relaxin 具
39、有较强的心肌保护及 抑制心肌纤维化的作用，但 relaxin 抗心肌纤维化的作用尚不清楚。本项目对 relaxin 抗 心肌纤维化的机制及信号转导通路进行研究， 确定内源性 relaxin 为机体内源性抗纤维化 的防御体系是前期工作的深入和延续。 本项目中采用的动物模型和刺激因素皆为国际通 用的经典模型和药物，本课题组已熟练掌握构建质粒、基因重组及转染、RT-PCR 、 Northern Blot 及 Western Blot 的技术和方法， 并熟悉项目所涉及的生化指标测定和生理 功能测定的方法和技术。 4 本项目的特色与 创新之处 大量研究表明，Relaxin 对皮肤、肝脏、肾脏 及肺等多种
40、组织器官具有显著的抗纤 维化作用， 我们前期工作也报道了 relaxin 改善 ISO 处理的大鼠心功 能， 抑制心肌纤维化， 在国际杂志发表后引起了学术界的高度关注和评价， 但有关 relaxin 抑制心肌纤维化的机 制尚不清楚。 与其他组织器官纤维化的发病不同， 心肌纤维化与其自身的旁/ 自分泌活性 物质 AngII 、 醛固酮的 功能紊乱关系更为密切，在多种因素诱导的心肌纤维化中都伴随 心肌 AngII 、 醛固酮基因 表达和活性的增强， 心脏内源性的 relaxin 系统是否通过对 AngII 、 醛固酮的调节， 实现抗心肌纤维化的作用， 尚未见报道。 通过此研究， 我们将首次证实 在
41、心肌纤维化发展中，内源性 relaxin 系统的变化及 relaxin 对 RAAS 系统的影响及作用 靶点，确定 relaxin 是机体内源性抗纤维化的防御体系，并确定 relaxin 抗心肌纤维化的 分子信号转导通路。 国家自然科学基 金申请书 第 12 页 版本 1.000.000 5年度研究计划及 预期研究结果 2007.12007.8： 在 ISO 诱导的大鼠亚急性心衰及腹主动脉结扎诱导的大鼠慢性心 衰模型上， 观察心脏内源性的 relaxin 1/3、LGR7 表达的变化； 研究外源性给予 relaxin 1 或 relaxin 3 后， 心肌纤维化个指标的变化，以确定 relax
42、in 的 抗心肌纤维化作用， 并筛选其作用的靶分子。 2007.92008.12：在 血管紧张素II、 醛固酮诱导的原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞 纤维化的模型上，观察 心脏内源性的 relaxin 1/3 、LGR7 表达的 变化；研究构建表达 relaxin 的腺病毒， 转染心肌成纤维细胞引起内源性的高表达 relaxin ， 及分别予以 relaxin 1 或 relaxin 3 预处 理后，心肌成纤维细胞的增殖及上述整体试验中初步确定的靶分 子的表达和活性的变化，进一步确定 relaxin 的抗心肌纤维化作用及其作用的靶分子。 2009.12009.12： 在原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞
43、， 分别利用 relaxin 作用的激 动剂和 拮抗剂，以上述试 验 中确 定的 靶分 子的表 达 和活 性的 变化 为指标 ， 确定 relaxin 抑制心肌纤维化的信号转导机制。研究 relaxin 预处理后，AngII 及 醛固酮诱导心肌纤 维化发生的分子信号的 mRNA 和蛋白表达及活性的变化，确定 relaxin 抑制 RAAS 诱导 心肌纤维化的分子靶点。 预期结果 ： 通过上述研究，预计发表 SCI 文章 2-3 篇，培 养 1-2 名研究生。 （二）研究基础与工 作条件 1. 工 作基础 本课题组一直致力于内源性的心血管活性物质的心血管效应及其机制研究， 并首先 报道了尾加压素
44、 II 、 肾 上腺髓质素、ghrelin 及 apelin 等多种心血管 旁自分泌物质在心血 管疾病中的作用及可能机制。2003 年始，我们室即开始关注 relaxin 的抗纤维化效应， 并跟踪报道了国际上有关 relaxin 的重大事件，同时 2005 年，我们实验室首先在国外杂 志上报道了 relaxin 在亚急性异丙肾上腺素 (Peptides ，2005；26：1632-1639) 诱导的大鼠 心肌坏死、 纤维化的模型上， 心脏内源性的 relaxin 表达、 合成增加 ， 外源性给予 relaxin 可以明显改善心功能， 减轻心肌缺血损伤， 抑制心肌纤维化， 据此我们认为 rela
45、xin 是一 国家自然科学基 金申请书 第 13 页 版本 1.000.000 种内源性的心脏保护物质。 我们的工作虽然发表时间不长， 但已受到了学术届的高度关 注，当年即被 SCI 引用 ，但 relaxin 的作用机制还有待于进一步深入研究。 已发表与 relaxin 相关的文章： 1. Zhang J, Qi YF , Geng B, Pan CS, Zhao J, Chen L, Yang J, Chang JK, Tang CS. Effect of relaxin on myocardial ischemia injury induced by isoproterenol. Pep
46、tides. 2005 Sep; 26(9):1632-9. 2. 张靓， 唐朝 枢。 松弛 素 的心血 管调 节作 用， 国外 医学生 理病 理科 学与 临床 分册，2004.5。 3. 张靓 ，唐 朝枢 。第 四届 国际松 弛素 及其 相关 肽会 议在美 召开 ，生 理科 学进 展，2005.1 。 2工作条件 申请者所在单位北京大学医学部生理与病理生理学系 （国家重点学科） 和北京大学 心血管研究所 （教育部分子生物学重点实验室） 能提供本项目研究所需的实验场所。 北 京大学心血管研究所为临床与基础相结合的研究所。 具有国内一流的细胞和分子生物学 实验设备，生理功能实验设备，如凝胶成像系
47、统、Odyssey 双红外激光成像系统等。申 请者所在单位动 物中心 能提供本项目所 需的合 格动物动物, 且 实验动 物与环境设施符合 壹级标准。缺少的本项目有关试剂，均可在国内外公司购买。 3. 申 请人简历 张靓，女，讲师。1976 年出生。1997 年毕业于扬州大学体育学院体育教育专业。 1997-2000 年在扬州大学体育学院运动科学研究所读硕士研究生， 获硕士学位。 2000-2003 在华东师范大学体育与健康学院读博士研究生， 师从 许豪文 教授， 博 士论文为 “运动与 动脉粥样硬化： 一氧化氮的作用及机制研究” ， 获理学博士学位。 2002.42004.4 主持江 苏省高校自然科学研究项目（运动对内皮功能的影响及其在动脉粥样硬化形成中的作 用，B0209088） ， 已结题。2004 年至今于北京大学医学部基础医学院生理与病理生理学 系博士后流动站工作， 方向为心血管活性物质与心血管疾病。 申请人在本项目中为项目 负责人。主要负责实验设计、资料的分析和处理和部分分子生物学实验。 近期发表 的论文： 近 3 年来在国内外发表或待发表第一作者和责任作者论文 7 篇， 参与 研究发表的论
