1、高 效 液 相 色 谱,（High Performance Liquid Chromatography）,基本原理,高效液相色谱法原理,当采用一种或多种测试方法不能直接确定混合物中特定或全部组份的组成或含量时，需要分离后再进行测定。,基于混合物中各组分与流动相和固定相作用力存在差异使得它们在色谱柱中停留时间不同而完成分离。 主要分离机理：分配、吸附,基本原理,色谱图(chromatogram) 色谱峰 保留时间(tR) 死时间(t0) 相对保留时间(tR) 峰面积(A) 峰高(h) 峰宽(W),T(min),S(mV),tR,t0,tR,A,h,色谱图：是指被分离组分的检测信号随时间分布的图象
2、。 色谱峰：组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线，流出曲线上的突起部分。 保留时间(tR)： 被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也既从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间，用tR表示，常以分（min）为时间单位。 死时间(t0) ：从进样到峰出现极大值的时间称为死时间。,基本原理,0,选择性,分离度,色谱柱塔板数,保留因子,基本原理,k = (tR t0)/t0= tR/t0,= k2/k1,流动相组成； 色谱柱； 温度,色谱柱长短； 流动相流量,基本原理,分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：,R 1.0 两峰明显重叠
3、 R = 1.0 两峰达97.7%分离 R 1.5 两峰完全分开,基本原理,不对称度 B/A 拖尾因子 (B + A)/2A,不对称度与拖尾因子,基本原理,小结,色谱法研究的核心：选择最适合的色谱体系和条件、在最短的时间达到最佳的分离效果。,基本原理,色谱理论,1、塔板理论,目的：从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过 这一方程各参数来研究影响分离的因素。,假设 （1）色谱柱存在多级塔板;（2）组分通过时在每级塔板两相间达 到一次平衡;,基本原理,理论塔板数N的计算,基本原理,相邻组分分离度的基本关系式：,分离度：,或,基本原理,1）、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该 方程可以
4、预测具有不同分配系数K的两种物质在塔板数为n的色谱柱上分离的情况；,2）、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数n，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好；,怎样提高色谱柱的理论塔板数n，从而提高色谱柱的效率？,基本原理,2、速率理论,塔板理论的不足塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。,Van Deemter方程1956年Van Deemter提出速率方程，指出了提高柱效率的途径：,式中：u为流动相流动的线速度,基本原理,（1）A为涡流扩散项：指固定相填充不均匀引起的扩散,基本原理,（2）B
5、/u 为纵向分子扩散项：指分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展宽,B = 2 r Dm,式中：r弯曲因子，填充柱 r 1空心柱r = 1Dm组分在流动相中的扩散系数,由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此在液相色谱中B可以忽略。,基本原理,（3）Cu传质阻力项指组分在流动相和固定相之间传质的阻力,固定相传质阻力 流动相传质阻力,q 和 为与两相的构型和性质有关的常数 dp 和 df 为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度,基本原理,色谱峰展宽 涡流扩散（多通道效应）,起始 填充床 最后,A = 2ldp dp 粒径, l 填充因子,基本原理,色谱峰展宽 纵向扩散,B= 2rDm 扩散
6、系数与温度成正比，与分子量平方根成反比，与流动相粘度成反比。,基本原理,色谱峰展宽 传质阻力(吸附动力学),基本原理,色谱峰展宽 柱外效应,柱外峰展宽,进样造成色谱峰展宽Ws,检测器产生的色谱峰展宽Wfs,连接管内色谱峰展宽W lc,W2 Wc2Ws2Wlc2Wfc2,基本原理,综上所述，速率方程为：,问题： 1、怎样装柱才能使色谱柱的效率提高？,2、空心柱是否能够用于色谱分离？,3、如何获得色谱最佳流速？,涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相内传质,基本原理,u 在上述方程各项中存在矛盾，因此，应求出最佳值：,基本原理,对速率方程的讨论,选用细颗粒填料可获高柱效 流动相流速低
7、，有利于达到高柱效 选用黏度小的流动相有利于提高柱效 温度的影响 液膜厚度的影响,HPLC的应用,1. 与经典液相色谱法的比较：,2.与气相色谱法比较,HPLC的应用,3. 应用由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。右图是各种HPLC方法的应用范围及对象。,HPLC的应用,1） 优点,分离效能高：柱效可达,选择性高：不仅可分析不同类型有机化合物及其同分异构体，还可
8、分析在性质上极为相似的旋光异构体，并已在高疗效的合成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重要作用。,检测灵敏度高：比如紫外检测器最小检出量可达,分析速度快：完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟,理论塔板数,，,荧光检测器，最小检出量可达,用于痕量分,析的,2）局限性,成本高，且易引起环境污染,梯度洗脱操作复杂,缺少如气相色谱法中使用的通用性检测器（如热导检测器和氢火焰离,不能分析受压易分解、变形的具有生物活性的生化样品,法的一种通用性检测器。,子化检测器）。近年来的蒸发激光散射检测器有望成为高效液相色谱,HPLC的应用,高压输液系统 1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金
9、)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进入泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。 3）高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。 输液泵种类：恒压型和恒流型。恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有
10、噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。,HPLC的应用,4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。,高压输液系统,HPLC的应用,高压输液系统,缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。,梯度洗脱,优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值 范围内。,HPLC的应用,进样系统与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括
11、：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。,HPLC的应用,分离系统,1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为1530cm，内径为45mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为： 平衡密度法：即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等
12、； 非平衡密度法：当采用粘度较大的试剂，如CCl4，CH3OH, 丙酮，二氧杂环已烷、THF等。 填充方法：填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。,HPLC的应用,分离系统,包括柱管与固定相两部分 一般色谱柱长530cm，内径为45mm 凝胶色谱柱内径312mm 微柱内径1-2mm，长1-5cm 制备往内径较大，可达25mm 以上,HPLC的应用,检测系统,紫外检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此时所采用的吸收池为微量吸收池，通
13、常其光程为2-10mm, 体积约为110 L。HPLC分析中，约有80%的物质可以在254 nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。,HPLC的应用,检测系统,响应特性,选择性检测器，如芳烃类化合物的检测 灵敏度高，可检测10-9g/mL的物质 线性范围宽，104-105 对温度及流动相的改变不敏感 适合梯度洗提 HPLC常规检测器,HPLC的应用,检测系统,示差折光检测器,利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏
14、转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。,HPLC的应用,检测系统,荧光检测器,利用某些溶质在受紫外光激发后，能发射可见光(荧光)的性质来进行检测的，是一种高灵敏度和高选择性的检测器。对不产生荧光的物质，可使其于与荧光试剂反应，制成可发生荧光的衍生物再进行测定。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高23个数量级。,HPLC的应用,检测系统,安培检测器,由恒电位仪和一薄层反应池（体积为15L）组成。 该检测器是利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应
15、，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物质。,HPLC的应用,检测系统,几种检测器特性比较,HPLC的应用,HPLC主要类型及其选择,化学键合相色谱法 液固色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 体积排阻色谱法,HPLC的应用,化学键合相色谱法,化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键
16、合相来说，以分配机理为主。通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：,Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适 于不含水或醇的流动相。 Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格式反应不方便。使 用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。 Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。,HPLC的应用,化学键合相色谱法,（1）分离机理 正相键合相色谱法：固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性或强极性化合物。分配机理：分配系数x为溶质，M为溶剂 反相键合相色谱法：固定相的极性小于流动相的极性，
17、适于分离非极性、极性和离子性化合物。应用最广泛,HPLC的应用,化学键合相色谱法,反相键合相色谱法的疏溶剂机理：溶质进入极性流动相后，排挤部分溶质分子，其疏水团由于流动相的斥力推动而直接与非极性固定相上的烷基缔合，构成单分子吸附层，这种作用时可逆的。当流动相极性减小，这种疏溶剂斥力下降。,HPLC的应用,化学键合相色谱法,正相和反相键合色谱法比较,正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比k增加。,在HPLC分析中，有时要在流动相中加入适量的盐(碳酸铵、四烷基铵盐)或酸，为什么？,答：都是为防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用； 加入酸是抑制酸类待测物的离解，使
18、其以游离酸在柱内分离。,HPLC的应用,化学键合相色谱法,常用固定相,HPLC的应用,化学键合相色谱法,HPLC的应用,化学键合相色谱法,HPLC的应用,化学键合相色谱法,流动相,表征溶剂特性的重要参数 溶剂强度：溶剂分子与吸附剂的亲合程度，越大，亲合力约大。 溶解度参数：衡量溶剂极性强度的指标，越大，极性越强。是溶剂和溶质分子间色散力、偶极力、接受质子或给予质子能力的总和。所以相近的混合溶剂，它的选择性不同。 极性参数P：溶剂与乙醇、二氧六环、硝基甲烷相互作用的度量，比较全面的反映了溶剂的性质。 粘度：,HPLC的应用,化学键合相色谱法,溶剂的选择原则,溶剂具有稳定的化学性质 溶剂的选择与使
19、用的检测器要有相容性 溶剂的粘度要小 溶剂的沸点不能太低 溶剂的纯度要高且价格便宜,HPLC的应用,液固色谱法,分离机理以固体吸附剂为固定相的液相色谱法。由于溶质分子和流动相分子在吸附剂表面的吸附活性中心上进行竞争吸附，这种竞争吸附形成不同溶质在吸附剂表面的吸附、解吸平衡。平衡常数的不同导致不同溶质得以分离。,固定相极性固定相：硅胶、氧化镁、氧化铝等非极性固定相：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等,HPLC的应用,液固色谱法,流动相1、越大，洗脱力越强。合适的洗脱强度可通过混合溶剂来得到 2、硅胶为固定相时：以弱极性的正构烷烃为主体，加入二氯甲烷等中等极性溶剂调节合适的洗脱强度。 3、可用水
20、对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋喃、乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂,HPLC的应用,液固色谱法,中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、芳烃等 不同极性取代基的化合物 结构异构体和几何异构体混合物的分离,HPLC的应用,离子对色谱法,分离机理将一种或数种与样品离子电荷（A+）相反的离子(B-)（称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱,HPLC的应用,离子对色谱法,固定相、流动相和离子对试剂,固定相：多为C18，C8反相键合相流动相：以水为主的缓冲液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶剂离子对试剂：四丁基铵正离子、十二烷基磺
21、酸根，十六烷基三甲基铵 正离子等,HPLC的应用,离子色谱法,分离机理试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生反应：阳离子交换：树脂SO3-H+M+=树脂SO3-M +H +阴离子交换：树脂NR3+Cl-+X-=树脂NR3+X -+Cl -,不同的离子与树脂离子的交换能力（亲和能力）不同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。,双柱抑制型：在分离柱和检测器之间加一个化学抑制器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景电导，二是增加被测离子的电导值，改善信噪比。灵敏度高。单柱非抑制型：淋洗液直接进入电导检测器。简单、分辨率较好。,HPLC的应用,离子色谱法,固定相离子交换剂，最常用的是乳胶薄壳型离子交换
22、树脂小球，根据功能基可分为：强酸型（磺酸基团）、强碱型（季铵基）、弱酸型（羧酸）、弱碱型（伯、仲、叔胺）,流动相双柱抑制型：分离阳离子，一般采用无机酸如HCl，HNO3等；分离阴离子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3。单柱非抑制型：分离阳离子，用低浓度的HCl，HNO3等；分离阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等 分析无机阴离子的首选方法；还可用于分析无机阳离子，有机酸、碱，糖类、蛋白质等。,HPLC的应用,体积排阻色谱法,分离原理 以多孔凝胶为固定相，利用精确控制的凝胶孔径，使样品中不同分子大小的组分得以分离。VR=V0+KDVp 0KD1.0 洗脱体积在V0 和V0 +Vp
23、之间，峰容量有限，10-12个峰 用于分离分子大小差大于10%的样品,HPLC的应用,体积排阻色谱法,使用水溶液的凝胶过滤色谱法（GFC），主要用于分析多肽、蛋 白质、核酸、多糖等。 使用有机溶剂的凝胶渗透色谱法(GPC)，主要用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的测定,软质凝胶：如交联葡聚糖等，水相分离生化体系，适于低、中压操作半刚性凝胶：较高交联度的苯乙烯、二乙烯苯共聚物，有机相洗脱，可承受10Mpa压力硬质凝胶: 高交联度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝胶渗透色谱法 多孔球形硅胶：凝胶过滤色谱法、凝胶渗透色谱法 羟基化聚醚多孔微球：凝胶过滤色谱法,固定相,HPLC的应用,体积排阻色谱法,流动相,改善分离主要通过固定相来实现。流动相的选择原则是：溶解样 品、与凝胶浸润、与检测器匹配、 粘度小。如四氢呋喃；缓冲溶液,应用,大分子的分离分析 聚合物分子量分布的测定,HPLC的应用,色谱分离方法选择,HPLC的发展方向,方法特点 1，分离效能高 2，检测灵敏度高 3，分析速度快 发展方向 1，高分辨率 2，高峰容量 3，高速,
