1、ICS xxxx xxxx DB23黑 龙 江 省 地 方 标 准DB 23 XXXXX2016实验动物 猫微生物学等级及监测2017 - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施黑 龙 江 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB23/T *2017目 录目录 I前言 .II1 范围 .12 规范性引用文件 .13 术语和定义 .14 微生物学等级分类 .25 检测要求 .26 检测程序 .37 检测方法 .38 检测规则 .49 结果判定 .510 判定结论 5附录 A.6附录 B.7附录 C.8附录 D.9附录 E 10附录 F 11附录 G12附录 H13I DB23
2、/ *20*前 言按 照 GB/T 1.12009的 编 写 规 则 起 草 。 本标准由黑龙江省质量技术监督局提出。 本标准由黑龙江省实验动物专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位： 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、 上海实验动物研究中心、 黑龙江省标准化研 究院、 东北农业大学、 黑龙江中医药大学、 哈尔滨医科大学附属第二医院、 北京世纪元亨动物防疫技术 有限公司、佳木斯大学。 本标准主要起草人：陆涛峰、周洁、宋莹、葛俊伟、李宝龙、郭守利、宋新刚、孙国志。 II DB23/T *20171 实 验 动 物 猫 微 生 物 学 等 级 及 监 测1 范围本标准主要规定了实验动物 猫 （以
3、 下简称实验猫） 微生物学等级及监测的术语和定义、 等级分类、检测要求、检测程序、检测方法、检测规则、结果判定、判定结论等。 本部分适用于实验猫微生物等级及监测。 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适 用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 14926.1 实 验 动 物 沙 门 菌 检 测 方 法 GB/T 14926.4 实 验 动 物 皮 肤 病 原 真 菌 检 测 方 法 GB/T 14926.14 实 验 动 物 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 测 方 法 GB/T 14
4、926.46 实 验 动 物 钩 端 螺 旋 体 检 测 方 法 GB/T 14926.50 实 验 动 物 实 验 动 物 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 GB/T 14926.56 实 验 动 物 狂 犬 病 病 毒 检 测 方 法 GB 19489 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求 NY/T 541兽 医 诊 断 样 品 采 集 、 保 存 与 运 输 技 术 规 范 3 术语和定义3.1GB/T 14922.1界 定 的 以 及 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准 。 实验猫经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚， 用于科学
5、研究、教学、生产和检定以及其它科学实验的猫。 3.2普通级猫3.3不携带所规定的人兽共患病病原和烈性传染病病原的实验猫。 无特定病原体级猫除普通级应排除的病原外， 不携带所规定的潜在感染或条件致病病原， 以及对科学实验 干扰大的病原的实验猫。 DB23/ *20*2 4 微生物学等级分类实验猫微生物学等级分为普通级和无特定病原体级。 5 检测要求5.1 病原微生物检测项目各等级实验猫病原微生物检测项目见表1。表1 实验猫微生物学检测项目等级 微生物 检测要求猫泛白细胞减少症病毒 Feline panleukopenia virus猫疱疹病毒 I 型 F eline herpesvirus ty
6、pe 1猫杯状病毒 F eline calicivirus普 通 猫狂犬病病毒 F eline rabies virus必须检测，可免疫沙门氏菌 Salmonella spp. 必须检测 致病性钩端螺旋体 L eptospira级 皮肤病原真菌 P athogenic dermal fungi必要时检测 猫传染性腹膜炎病毒 F eline infectious peritonitis virus无 特 猫巴尔通体 B artonella定 病 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus必须检测 原 体 猫免疫缺陷病毒 F eline immunodeficiency virus
7、级 猫白血病病毒 F eline leukosis virus必要时检测 5.2 检测项目分类5.2.1 必须检测项目在进行实验动物猫质量评价时必须检测的项目。 普通级可免疫项目， 无特定病原体级不 能免疫。5.2.2 必要时检测项目DB23/T *20173 编号耳后、背部毛发或皮屑采血鼻拭子、肛拭子（或新鲜粪便）申请生产许可证、 从国外引进实验动物猫、 为补充种源野外捕获、 疑有该病原体感染和 实验特殊需要时应检测的项目。 6 检测程序检测程序见图 1。外观检查采样真菌检查血清抗体检查病原体检查检测结果判定检测结论图 1 检测程序7 检测方法检测方法见表 2. 表 2 实验猫病原微生物检测
8、方法病原 检测方法猫泛白细胞减少症病毒 抗体按 GB/T 14926.50 检测 病原采用 PCR 方法检测，见附录 A 猫疱疹病毒 1 型 抗体按 GB/T 14926.50 检测 病原采用 PCR 方法检测，见附录 B 猫杯状病毒 抗体按 GB/T 14926.50 检测 病原采用 RT-PCR 方法检测，见附录 C 猫狂犬病毒 抗体按 GB/T 14926.50 检测 DB23/ *20*4 病原采用巢式 PCR 方法检测，见附录 D 沙门氏菌 按 GB/T 14926.1 检测 皮肤病原真菌 按 GB/T 14926.4 检测 钩端螺旋体 按 GB/T 14926.46 检测 猫传染性
9、腹膜炎病毒 抗体按 GB/T 14926.50 检测 病原采用巢式 PCR 方法检测，见附录 E 猫白血病病毒 抗体按 GB/T 14926.50 检测 病原采用巢式 PCR 方法检测，见附录 F 猫免疫缺陷病毒 抗体按 GB/T 14926.50 检测 病原采用巢式 PCR 方法检测，见附录 G 猫巴尔通体 采用 PCR 方法检测，见附录 H 金黄色葡萄球菌 按 GB/T 14926.14 检测 8 检测规则8.1 检测频率每六个月至少检测一次。 8.2 抽样8.2.1 方式随机抽样， 选择三月龄以上的实验猫用于检测。 对实验猫月龄有特殊要求的， 三月龄以 下的实验猫也可依据本标准进行抽样。
10、 8.2.2 数量根据实验猫群体大小，抽样数量见表3。建议根据不同的感染情况和生物统计学意义等 计 算 实 际 的 抽 样 数 量 ， 但 最 低 数 量 不 得 低 于 表 3要 求 。表3 抽样数量群体大小（只） 抽样数量小于100 不少于5只 100500 不少于10只 大于500 不少于15只 8.2.3 方法8.2.3.1 可 按 病 毒 、 细 菌 、 真 菌 、 寄 生 虫 检 测 要 求 联 合 采 样 。 8.2.3.2 采 样 方 法 按 照 NY/T 541 进 行 。 8.2.3.3 检 测 金 黄 色 葡 萄 球 菌 时 ， 参 照 GB 19489 的 要 求 实
11、施 。 8.2.3.4 检 测 结 果 存 疑 ， 需 要 进 一 步 确 诊 时 ， 应 结 合 临 床 症 状 和 前 期 检 测 结 果 ， 按 照 表 2中的要求采集动物组织或特定样本，以做进一步检测。 8.3 样 本 要 求 DB23/T *20175 样 本 要 求 有 明 显 标 识 ， 写 明 检 品 名 称 、 品 系 、 等 级 、 数 量 及 检 测 项 目 等 内 容 ， 安 全 送 达 实验室。 9 结果判定9.1 抗体检查免 疫 项 目 ， 群 体 免 疫 合 格 率 大 于 等 于 70%， 判 为 合 格 。 非免疫项目，血清抗体阴性判为合格。 9.2 病原和核
12、酸检测未见阳性结果为合格。 10 判定结论在检测的各等级动物中， 如有某项指标不符合该等级标准指标要求， 则判为不符合该等 级标准。 DB23/ *20*6 附录A（规范性附录） 猫泛白细胞减少症病毒PCR检测方法采用PC R方法 ， 特异性扩增猫泛白细胞减少症病毒V P2基因片段， 用于猫泛白细胞减少症 病毒的检测。 A.1 病 毒 DNA的 提 取按 照 病 毒 DNA提 取 试 剂 盒 操 作 方 法 进 行 ， 提 取 的 DNA于 -20 保 存 、 备 用 。 A.2 PCR反 应 引 物上 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： CTGCTACTCAGCCACCAACT 下 游 引
13、 物 序 列 （ 5-3） ： TGGTGGTAAGCCCAATGCTC A.3 PCR反 应 条 件95预变性5 m in； 95 变 性 30 s，60退火30 s ， 72 延 伸 30s， 30个 循 环 ； 72 延 伸 2min。 A.4 PCR产 物A.4.1 产物大小401bp。 A.4.1 产物参考序列CTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATA ATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAAC
14、CAACCATACCAACTCC ATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATGTATAT CATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGAAAATTCTGTACCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATG AATTTGCTACAGGAACATTTTTTTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGG CTTACCACCA。 DB23/T *20177 附录B（规范性附录） 猫疱疹病毒1
15、型检测方法采 用 PCR方 法 ， 特 异 性 扩 增 猫 疱 疹 病 毒 1型 UL24基 因 片 段 ， 用 于 猫 疱 疹 病 毒 1型 的 检 测 。 B.1 病 毒 DNA的 提 取按 照 病 毒 DNA提 取 试 剂 盒 操 作 方 法 进 行 ， 提 取 的 DNA于 -20 保 存 、 备 用 。 B.2 PCR反 应 引 物上 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： GCGGATTACACCACCACTCT 下 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： AAAGGCTAAGGGCGTGTACC B.3 PCR反 应 条 件95预 变性5m in； 95变性30 s， 60退火3 0
16、s， 72延伸 30s， 30个循环； 72延伸 2min。 B.4 PCR产 物B.4.1 产物大小409bp。 B.4.2 产物参考序列GCGGATTACACCACCACTCTCGATTGGATTGTATTCGGCGAGCTTGGTAATATTAGCAGCCAGAACAGAAATGTT ACTCGTAAGCATCTGCGGGGGTAAACTAGTAACTCCCAAAATTCTCAGACCGCGCTGCGCGATAAATGCCAATATGGGT ATTAGAGTGAGCTTCTCCCCCCCTGGTGGTAGAATCTTGGTTATTAAACCCACAGAATCTGTTAATTGTTTCAA
17、ACCCT CACGACGTTGAATGTCTTTACTAGTTGTATCCATATTTTTTGAAAAACGACACGTTTTCAGCTCAATTAGAAAACATAT ACCACCCCCTTCTCCCTCAAATTGTATAGTACATACACAATCAGGTCGGCGACGACCCAAGTTAACCTCACATGCTAGG TACACGCCCTTAGCCTTT DB23/ *20*8 附录C（规范性附录） 猫杯状病毒RT-PCR检测方法采 用 RT-PCR方 法 ， 特 异 性 扩 增 猫 杯 状 病 毒 VP1基 因 片 段 ， 用 于 猫 杯 状 病 毒 的 检 测 。 C.1 病
18、毒 RNA的 提 取按 照 病 毒 RNA提 取 试 剂 盒 操 作 方 法 进 行 ， 提 取 的 RNA于 -20 保 存 、 备 用 。 C.2 PCR反 应 引 物上 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： AACCTGCGCTAACGTGCTT 下 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： CAGTGACAATACACCCAGAA C.3 反转录使 用 反 转 录 试 剂 盒 对 所 提 RNA进 行 反 转 录 ， 制 备 cDNA。 C.4 PCR反 应 条 件95预 变性5m in； 95变性30 s， 55退火4 0s， 72延伸 1min， 30个循环； 72延伸 2min。 C
19、.5 PCR产 物C.5.1 产物大小926bp。 C.5.2 产物参考序列AACCTGCGCTAACGTGCTTAAATACTATGATTGGGATCCCCACATCAGATTGGTTATCAACCCCAATAAATTTCT TCCTATTGGTTTCTGTGATAATCCTCTAATGTGTTGCTACCCAGAATTGCTCCCAGAATTCGGAACTGTGTGGGATTGT GATCAATCCCCACTGCAAATCTACCTGGAGTCAATCCTTGGTGATGATGAATGGGCTTCAACTTACGATGCCATTGACC CTGTTGTTCCACCAATGCACTGGGAC
20、GATGCAGGCAAGATCTTCCAACCTCACCCTGGAGTTCTGATGCATTTTCTAAT AAATGAAGTTGCAAAGGGCTGGGATCCAAGTTTGCCATCCTTCCGTTTGGAAGCAGATGACGGATCCATAACCACACCT GAACAGGGTACTGCGGTTGGTGGCGTCATTGCCCAACCCAGCGCTCAAATGTCGGCAGCTGCAGACATGGCATCTGGTA AGAGTGTTGACTCTGAGTGGGAGGAATTCTTTTCCTTCCATACTAGTGTCAACTGGAGCACAACTGAAACACAAGGAAA GATTCT
21、GTTCAAACAGTCACTGGGACCCCTTCTCAACCCTTACCTTGAACACTTATCTAAACTCTATGTTGCTTGGTCA GGCTCTATAGATGTTAGGTTTTCTATCTCTGGTTCTGGTGTCTTTGGGGGAAAACTAGCCGCAATAGTTGTCCCACCTG GTGTCGATCCTGTCCAAAGCACTTCCATGCTACAATACCCTCATGTGTTGTTTGATGCTCGACAGGTTGAACCAGTGAT CTTTTCTCTCCCTGATCTGAGGAATTCACTATATCACCTCATATCTGATACTGATACTACATCTCT
22、GGTAATAATGGTT TACAATGATCTTATTAACCCCTATGCAAATGAAGCTAACTCTTCTGGGTGTATTGTCACTG DB23/T *20179 附录D（规范性附录） 猫狂犬病病毒巢式RT-PCR检测方法采 用 巢 式 RT-PCR方 法 ， 扩 增 猫 狂 犬 病 病 毒 基 因 片 段 ， 用 于 猫 狂 犬 病 病 毒 的 检 测 。 D.1 病 毒 RNA的 提 取按 照 病 毒 RNA提 取 试 剂 盒 操 作 方 法 进 行 ， 提 取 的 RNA于 -20 保 存 、 备 用 。 D.2 PCR反 应 引 物 D.2.1 第一次反应引物上 游 引
23、 物 序 列 （ 5-3） ： GTGTAACACCTCTACAATGG 下 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： ACAGTCTCYTCNGCCATCT D.2.2 第二次反应引物上 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： CAAGATGTGYGCYAAYTGGAG 下 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： AGCCCTGGTTCGAACATTCT （ 简 并 引 物 ， 其 中 Y=C/T， N=A/C/G/T） D.3 反转录使 用 反 转 录 试 剂 盒 对 所 提 RNA进 行 反 转 录 ， 制 备 cDNA。 D.4 PCR反 应 条 件D.4.1 第 一 次 PCR反 应 条 件
24、以 制 备 的 cDNA为 模 板 ， 进 行 第 一 次 PCR反 应 ， 条 件 如 下 ： 95预变性 5min； 95变 性30 s， 56 退火30 s， 72延伸30 s， 30个循环； 72延伸2m in。 D.4.2 第 二 次 PCR反 应 条 件以 第 一 次 PCR产 物 为 模 板 ， 进 行 第 二 次 PCR反 应 ， 条 件 如 下 ： 95预变性 5min； 95变 性30 s， 56 退火30 s， 72延伸30 s， 30个循环； 72延伸2m in。 D.5 PCR产 物C.5.1 产物大小239bp。 D.5.2 产物参考序列CAAGATGTGCGCTA
25、ACTGGAGTACCATCCCGAACTTTAGATTCTTAGCTGGAACCTACGACATGTTTTTCTCTCG GATTGAGCATTTGTACTCAGCTATAAGAGTGGGCACAGTTGTCACTGCTTATGAAGACTGCTCAGGGTTGGTATCGTTC ACAGGGTTCATAAAGCAAATAAATCTCACCGCGAGAGAGGCAATCCTATATTTCTTCCACAAGAACTTTGAGGAAGAAA TAAGAA DB23/ *20*10 附录E（规范性附录） 猫传染性腹膜炎病毒RT-PCR检测方法采用RT-PCR方法，特异性扩增猫传染性腹膜炎病毒ORF
26、1b基因片段，用于猫传染性腹膜 炎病毒的检测。 E.1 病 毒 RNA的 提 取按 照 病 毒 RNA提 取 试 剂 盒 操 作 方 法 进 行 ， 提 取 的 RNA于 -20 保 存 、 备 用 。 E.2 PCR反 应 引 物上 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： GTGATGCTATCATGACTAG 下 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： CACCATTACAACCTTCTAA E.3 反转录使 用 反 转 录 试 剂 盒 对 所 提 RNA进 行 反 转 录 ， 制 备 cDNA。 E.4 PCR反 应 条 件95预 变性2m in； 95变性30 s， 48退火3 5s， 7
27、2延伸 45s， 30个循环； 72延伸 5min。 E.5 PCR产 物E.5.1 产物大小417bp。 E.5.2 产物参考序列GTGATGCTATCATGACTAGGTGTCTTGCTATATATGATTGTTTTGTCAAACGTGTAGATTGGTCCATTGTGTACC CTTTTATTGAAAATGAAGAGAAGATCAATAAAGCTGGTCGCATTGTACAATCACATGTCATGAGAGCTGCTCTTAAAGT TTTCAACCCTGCTGCAATTCACGATGTTGGTAATCCAAAAGGTATTCGTTGTGCTGCGACACCCATACCGTGGTTTTG
28、T TATGACCGTGATCCTATTAATAACAATGTTAGATGTCTGGAGTATGATTACATGGTACATGGACAAATGAATGGTTTAA TGTTGTTTTGGAATTGTAACGTAGACATGTACCCAGAGTTCTCAATTGTCTGTAGATTTGATACTCGGACCCGCTCAAA ATTGTCATTAGAAGGTTGTAATGGTG DB23/T *201711 附录F（规范性附录） 猫白血病病毒巢式RT-PCR检测方法采用巢式RT -PCR方法，特 异性扩增猫白血病病毒基因片段，用于猫白血病病毒的检测。 F.1 病 毒 RNA的 提 取按 照 病 毒
29、 RNA提 取 试 剂 盒 操 作 方 法 进 行 ， 提 取 的 RNA于 -20 保 存 、 备 用 。 F.2 PCR反 应 引 物 F.2.1 第一次反应引物上 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： ACAGCAGAAGTTTCAAGGCC 下 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： GACCAGTGATCAAGGGTGAG F.2.2 第二次反应引物上 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： GCTCCCCAGTTGACCAGAGT 下 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： GCTTCGGTACCAAACCGAAA F.3 反转录使 用 反 转 录 试 剂 盒 对 所 提 RNA进 行
30、反 转 录 ， 制 备 cDNA。 F.4 PCR反 应 条 件F.4.1 第 一 次 PCR反 应 条 件以 制 备 的 cDNA为 模 板 ， 进 行 第 一 次 PCR反 应 ， 条 件 如 下 ： 95预变性 2min； 95变 性45 s， 58 退火30 s， 72延伸1m in， 35个循环； 72延伸7m in。 F.4.2 第 二 次 PCR反 应 条 件以 第 一 次 PCR产 物 为 模 板 ， 进 行 第 二 次 PCR反 应 ， 条 件 如 下 ： 95预变性 2min； 95变 性45 s， 58 退火30 s， 72延伸1m in， 35个循环； 72延伸7m i
31、n。 F.5 PCR产 物F.5.1 产物大小601bp。 F.5.2 产物参考序列GCTCCCCAGTTGACCAGAGTTCGACCTTCCGCCTCATTTAAACTAACCAATCCCCATGCCTCTCGCTTCTGTACG CGCGCTTTCTGCTATAAAACGAGCCATCAGCCCCCAACGGGCGCGCAAGTCTTTGCTGAGACTTGACCGCCCCGGGTAC CCGTGTACGAATAAACCTCTTGCCGATTGCATCTGACTCGTGGTCTCGGTGTTCCGTGGGCGCGGGGCCTCATCGCCGA GGAAGACCCAGTTCGGGGGTCT
32、TTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATAGAGACCCCCAACCCCCGGGACCACCGACCCAC CATCAGGAGGTAAGCTGGCCGGCGACCATATCTGTTGTCCTTGTATAAGTGTCTCTGTCAATTGATCTGATTTTGGCGG TGGGATCGAAGGAGCTGACGAGCTCGTACTTCGCCCCCGCAACCCTGGAAGACGTTCCACGGGTGTCTGATGTCTGGAG CCTCTAGTGGGACAGCCATTGGGGCTCATCTGTTTGGGGTCTCACCTGAATACAGGGTGTTGATCGGAGACGAGGGAGC CG
33、GACCCTCAAAGTCTCTTTCTGAGGTTTCATTTTCGGTTTGGTACCGAAGC DB23/ *20*12 附录G（规范性附录） 猫免疫缺陷病毒巢式RT-PCR检测方法采用巢式RT-PCR方法，特异性扩增猫免疫缺陷病毒pol基因片段，用于猫免疫缺陷病毒 的检测。 G.1 病 毒 RNA的 提 取按 照 病 毒 RNA提 取 试 剂 盒 操 作 方 法 进 行 ， 提 取 的 RNA于 -20 保 存 、 备 用 。 G.2 PCR反 应 引 物 G.2.1 第一次反应引物上 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： TGGCCWYTAWCWAATGAAAARATWGAAGC 下
34、 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： GTAATTTRTCTTCHGGNGTYTCAAATCCCC G.2.2 第二次反应引物上 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： TGAAAARATWGAAGCHTTAACAGAMATAG 下 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： GTAATTTRTCTTCHGGNGTYTCAAATCCCC G.3 反转录.使 用 反 转 录 试 剂 盒 对 所 提 RNA进 行 反 转 录 ， 制 备 cDNA。 G.4 PCR反 应 条 件G.4.1 第 一 次 PCR反 应 条 件以 制 备 的 cDNA为 模 板 ， 进 行 第 一 次 PCR反 应 ， 条 件
35、 如 下 ： 95预变性 2min； 95变 性45 s， 58 退火30 s， 72延伸1m in， 35个循环； 72延伸7m in。 G.4.2 第 二 次 PCR反 应 条 件以 第 一 次 PCR产 物 为 模 板 ， 进 行 第 二 次 PCR反 应 ， 条 件 如 下 ： 95预变性 2min； 95变 性45 s， 58 退火30 s， 72延伸1m in， 35个循环； 72延伸7m in。 G.5 PCR产 物G.5.1 产物大小578bp。 G.5.2 产物参考序列TGAAAAAATTGAAGCCTTAACAGAAATAGTAGAAAGACTAGAAAGAGAAGGGAA
36、AGTAAAAAGAGCAGATCCAAA TAATCCATGGAATACACCAGTATTTGCTATAAAAAAGAAAAGTGGAAAATGGAGAATGCTCATAGATTTTAGAGAATTA AACAAACTAACTGAGAAAGGAGCAGAGGTCCAGTTGGGACTACCTCATCCTGCTGGTTTACAAATAAAAAAACAAGTAA CAGTATTAGATATAGGGGATGCATATTTCACCATTCCTCTTGATCCAGATTATGCTCCTTATACAGCATTTACTTTACC TAGAAAAAATAATGCGGGACCAGGAAGGAGATTTGTGT
37、GGTGTAGTCTACCACAAGGCTGGATTTTAAGTCCATTGATA TATCAAAGTACATTAGATAATATAATACAACCTTTTATTAGACAAAATCCTCAATTAGATATTTACCAATATATGGATG ACATTTATATAGGATCAAATTTAAGTAAAAAGGAGCATAAAGAAAAGGTAGAAGAATTAAGAAAATTACTATTATGGTG GGGATTTGAAACTCCAGAAGATAAATTAC DB23/T *201713 附录H（规范性附录） 猫血巴尔通体PCR检测方法采用PC R方法 ， 特异性扩增猫血巴尔通体16 S rD
38、NA基因片段， 用于猫血巴尔通体的检测。 H.1 DNA的 提 取按 照 DNA提 取 试 剂 盒 操 作 方 法 进 行 ， 提 取 的 DNA于 -20 保 存 、 备 用 。 H.2 PCR反 应 引 物上 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： TCACAATGGACGAAAGTCTG 下 游 引 物 序 列 （ 5-3） ： CCAAACATCTCAAGACACGAG H.3 PCR反 应 条 件以 提 取 的 DNA为 模 板 ， 进 行 PCR反 应 ， 条 件 如 下 ： 95预变性 2min； 95变 性15 s， 55 退火30 s， 72延伸1m in， 35个循环； 72
39、延伸5m in。 H.4 PCR产 物H.4.1 产物大小711bp。 H.4.2 产物参考序列TCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATACCACGTGAACGATGAAGGTCTTCTGATTGTAAAGTTCTTTTATT TAGGAAAAAAAGCGCGCTAGGAAATGAGCGCGCCTTGATGGTACTAATTGAATAAGTGACAGCTAACTATGTGCCAGCA GCTGCGGTAAAACATAGGTCACGAGCATTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGAAGCGTAGGTGGGGAGGTTGATCCAT TGTTAAAGGCATTTGC
40、TTAACAAATGTGTGCGATGGAGATCGCCTCCCTAGAGTTAATCAGGGGGTACTGGAATTCAAT GTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATTGAGGAACACCAGAGGCTAAGGCGAGTGCCTAGGATATAACTGACACTGAGG CTTGAAAGCGTGGGGAGCAAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGGCATTAGGTATTTGACAT CTAGTCGAGTGCTGTAGCTAACGCGTTAAATGCCCCGCCTGGGTAGTATATATGCAAATATGAAACTCAAAGAAATTGA CGGGGACCTGAACAAGTGGTGGAGCATGTTGCTTAATTCGATAATACACGAAAAACCTTACCAAGGCTTGCAATCTACT GCAAAGCTATAGAAATATAGTGGAGGCAATCAGTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCTTGAGATGT TTGG
