1、ICS xxxxxxxxDB23黑 龙 江 省 地 方 标 准DB 23 XXXXX2016实验动物 猫微生物学等级及监测2017 - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施黑 龙 江 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB23/T *2017I目 录目录 .I前言 II1 范围 .12 规范性引用文件 .13 术语和定义 .14 微生物学等级分类 .25 检测要求 .26 检测程序 .37 检测方法 .38 检测规则 .49 结果判定 .410 判定结论 5附录 A .6附录 B .7附录 C .8附录 D .9附录 E 10附录 F 11附录 G 12附录 H 13DB2
2、3/ *20*II前 言按照GB/T 1.12009的编写规则起草。本标准由黑龙江省质量技术监督局提出。本标准由黑龙江省实验动物专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、上海实验动物研究中心、黑龙江省标准化研究院、东北农业大学、黑龙江中医药大学、哈尔滨医科大学附属第二医院、北京世纪元亨动物防疫技术有限公司、佳木斯大学。本标准主要起草人：陆涛峰、周洁、宋莹、葛俊伟、李宝龙、郭守利、宋新刚、孙国志。DB23/T *20171实验动物 猫微生物学等级及监测1 范围本标准主要规定了实验动物 猫（以下简称实验猫）微生物学等级及监测的术语和定义、等级分类、检测要求、检测程序
3、、检测方法、检测规则、结果判定、判定结论等。本部分适用于实验猫微生物等级及监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 14926.1 实验动物 沙门菌检测方法GB/T 14926.4 实验动物 皮肤病原真菌检测方法GB/T 14926.14 实验动物 金黄色葡萄球菌检测方法GB/T 14926.46 实验动物 钩端螺旋体检测方法GB/T 14926.50 实验动物 实验动物酶联免疫吸附试验GB/T 14926.56 实验动物 狂犬病病毒检测方法GB
4、19489 实验室 生物安全通用要求NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 术语和定义GB/T 14922.1界定的以及下列术语和定义适用于本标准。3.1 实验猫经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检定以及其它科学实验的猫。3.2 普通级猫不携带所规定的人兽共患病病原和烈性传染病病原的实验猫。3.3无特定病原体级猫除普通级应排除的病原外，不携带所规定的潜在感染或条件致病病原，以及对科学实验干扰大的病原的实验猫。DB23/ *20*24 微生物学等级分类实验猫微生物学等级分为普通级和无特定病原体级。5 检测要求5.
5、1 病原微生物检测项目各等级实验猫病原微生物检测项目见表1。表 1 实验猫微生物学检测项目等级 微生物 检测要求猫泛白细胞减少症病毒 Feline panleukopenia virus猫疱疹病毒 I 型 Feline herpesvirus type 1猫杯状病毒 Feline calicivirus猫狂犬病病毒 Feline rabies virus必须检测，可免疫沙门氏菌 Salmonella spp. 必须检测致病性钩端螺旋体 Leptospira普通级皮肤病原真菌 Pathogenic dermal fungi必要时检测猫传染性腹膜炎病毒 Feline infectious peri
6、tonitis virus猫巴尔通体 Bartonella金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus必须检测猫免疫缺陷病毒 Feline immunodeficiency virus无特定病原体级猫白血病病毒 Feline leukosis virus必要时检测5.2 检测项目分类5.2.1 必须检测项目在进行实验动物猫质量评价时必须检测的项目。普通级可免疫项目，无特定病原体级不能免疫。5.2.2 必要时检测项目DB23/T *20173申请生产许可证、从国外引进实验动物猫、为补充种源野外捕获、疑有该病原体感染和实验特殊需要时应检测的项目。6 检测程序检测程序见图 1。图 1
7、检测程序7 检测方法检测方法见表 2.表 2 实验猫病原微生物检测方法病原 检测方法猫泛白细胞减少症病毒 抗体按 GB/T 14926.50 检测病原采用 PCR 方法检测，见附录 A猫疱疹病毒 1 型 抗体按 GB/T 14926.50 检测病原采用 PCR 方法检测，见附录 B猫杯状病毒 抗体按 GB/T 14926.50 检测病原采用 RT-PCR 方法检测，见附录 C猫狂犬病毒 抗体按 GB/T 14926.50 检测编号外观检查检测结果判定检测结论采样耳后、背部毛发或皮屑 真菌检查采血鼻拭子、肛拭子（或新鲜粪便）血清抗体检查病原体检查DB23/ *20*4病原采用巢式 PCR 方法检
8、测，见附录 D沙门氏菌 按 GB/T 14926.1 检测皮肤病原真菌 按 GB/T 14926.4 检测钩端螺旋体 按 GB/T 14926.46 检测猫传染性腹膜炎病毒 抗体按 GB/T 14926.50 检测病原采用巢式 PCR 方法检测，见附录 E猫白血病病毒 抗体按 GB/T 14926.50 检测病原采用巢式 PCR 方法检测，见附录 F猫免疫缺陷病毒 抗体按 GB/T 14926.50 检测病原采用巢式 PCR 方法检测，见附录 G猫巴尔通体 采用 PCR 方法检测，见附录 H金黄色葡萄球菌 按 GB/T 14926.14 检测8 检测规则8.1 检测频率每六个月至少检测一次。8
9、.2 抽样8.2.1 方式随机抽样，选择三月龄以上的实验猫用于检测。对实验猫月龄有特殊要求的，三月龄以下的实验猫也可依据本标准进行抽样。8.2.2 数量根据实验猫群体大小，抽样数量见表3。建议根据不同的感染情况和生物统计学意义等计算实际的抽样数量，但最低数量不得低于表3要求。表3 抽样数量群体大小（只） 抽样数量小于100 不少于5只100500 不少于10只大于500 不少于15只8.2.3 方法8.2.3.1 可按病毒、细菌、真菌、寄生虫检测要求联合采样。8.2.3.2 采样方法按照 NY/T 541 进行。8.2.3.3 检测金黄色葡萄球菌时，参照 GB 19489 的要求实施。8.2.
10、3.4 检测结果存疑，需要进一步确诊时，应结合临床症状和前期检测结果，按照表 2中的要求采集动物组织或特定样本，以做进一步检测。8.3 样本要求DB23/T *20175样本要求有明显标识，写明检品名称、品系、等级、数量及检测项目等内容，安全送达实验室。9 结果判定9.1 抗体检查免疫项目，群体免疫合格率大于等于70%，判为合格。非免疫项目，血清抗体阴性判为合格。9.2 病原和核酸检测未见阳性结果为合格。10 判定结论在检测的各等级动物中，如有某项指标不符合该等级标准指标要求，则判为不符合该等级标准。DB23/ *20*6附录A（规范性附录）猫泛白细胞减少症病毒PCR检测方法采用PCR方法，特
11、异性扩增猫泛白细胞减少症病毒VP2基因片段，用于猫泛白细胞减少症病毒的检测。A.1 病毒DNA的提取按照病毒DNA提取试剂盒操作方法进行，提取的DNA于-20保存、备用。A.2 PCR反应引物上游引物序列（5-3）：CTGCTACTCAGCCACCAACT下游引物序列（5-3）：TGGTGGTAAGCCCAATGCTCA.3 PCR反应条件95预变性5 min；95 变性30 s，60退火30 s，72延伸30s，30个循环；72延伸2min。A.4 PCR产物A.4.1 产物大小401bp。A.4.1 产物参考序列CTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATT
12、TAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATGTATATCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGAAAATTCTGTACCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTTTTTTG
13、ATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCA。DB23/T *20177附录B（规范性附录）猫疱疹病毒1型检测方法采用PCR方法，特异性扩增猫疱疹病毒1型UL24基因片段，用于猫疱疹病毒1型的检测。B.1 病毒DNA的提取按照病毒DNA提取试剂盒操作方法进行，提取的DNA于-20保存、备用。B.2 PCR反应引物上游引物序列（5-3）：GCGGATTACACCACCACTCT下游引物序列（5-3）：AAAGGCTAAGGGCGTGTACCB.3 PCR反应条件95预变性5min；95变性30s，60退火30s，72
14、延伸30s，30个循环；72延伸2min。B.4 PCR产物B.4.1 产物大小409bp。B.4.2 产物参考序列GCGGATTACACCACCACTCTCGATTGGATTGTATTCGGCGAGCTTGGTAATATTAGCAGCCAGAACAGAAATGTTACTCGTAAGCATCTGCGGGGGTAAACTAGTAACTCCCAAAATTCTCAGACCGCGCTGCGCGATAAATGCCAATATGGGTATTAGAGTGAGCTTCTCCCCCCCTGGTGGTAGAATCTTGGTTATTAAACCCACAGAATCTGTTAATTGTTTCAAACCCTCACGACGTT
15、GAATGTCTTTACTAGTTGTATCCATATTTTTTGAAAAACGACACGTTTTCAGCTCAATTAGAAAACATATACCACCCCCTTCTCCCTCAAATTGTATAGTACATACACAATCAGGTCGGCGACGACCCAAGTTAACCTCACATGCTAGGTACACGCCCTTAGCCTTTDB23/ *20*8附录C（规范性附录）猫杯状病毒RT-PCR检测方法采用RT-PCR方法，特异性扩增猫杯状病毒VP1基因片段，用于猫杯状病毒的检测。C.1 病毒RNA的提取按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于-20保存、备用。C.2 PCR反应引
16、物上游引物序列（5-3）：AACCTGCGCTAACGTGCTT下游引物序列（5-3）：CAGTGACAATACACCCAGAAC.3 反转录使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备cDNA。C.4 PCR反应条件95预变性5min；95变性30s，55退火40s，72延伸1min，30个循环；72延伸2min。C.5 PCR产物C.5.1 产物大小926bp。C.5.2 产物参考序列AACCTGCGCTAACGTGCTTAAATACTATGATTGGGATCCCCACATCAGATTGGTTATCAACCCCAATAAATTTCTTCCTATTGGTTTCTGTGATAATCCTCTAA
17、TGTGTTGCTACCCAGAATTGCTCCCAGAATTCGGAACTGTGTGGGATTGTGATCAATCCCCACTGCAAATCTACCTGGAGTCAATCCTTGGTGATGATGAATGGGCTTCAACTTACGATGCCATTGACCCTGTTGTTCCACCAATGCACTGGGACGATGCAGGCAAGATCTTCCAACCTCACCCTGGAGTTCTGATGCATTTTCTAATAAATGAAGTTGCAAAGGGCTGGGATCCAAGTTTGCCATCCTTCCGTTTGGAAGCAGATGACGGATCCATAACCACACCTGAACAGGGTACTG
18、CGGTTGGTGGCGTCATTGCCCAACCCAGCGCTCAAATGTCGGCAGCTGCAGACATGGCATCTGGTAAGAGTGTTGACTCTGAGTGGGAGGAATTCTTTTCCTTCCATACTAGTGTCAACTGGAGCACAACTGAAACACAAGGAAAGATTCTGTTCAAACAGTCACTGGGACCCCTTCTCAACCCTTACCTTGAACACTTATCTAAACTCTATGTTGCTTGGTCAGGCTCTATAGATGTTAGGTTTTCTATCTCTGGTTCTGGTGTCTTTGGGGGAAAACTAGCCGCAATAGTTGTCCCAC
19、CTGGTGTCGATCCTGTCCAAAGCACTTCCATGCTACAATACCCTCATGTGTTGTTTGATGCTCGACAGGTTGAACCAGTGATCTTTTCTCTCCCTGATCTGAGGAATTCACTATATCACCTCATATCTGATACTGATACTACATCTCTGGTAATAATGGTTTACAATGATCTTATTAACCCCTATGCAAATGAAGCTAACTCTTCTGGGTGTATTGTCACTGDB23/T *20179附录D（规范性附录）猫狂犬病病毒巢式RT-PCR检测方法采用巢式RT-PCR方法，扩增猫狂犬病病毒基因片段，用于猫狂犬病病毒的检测
20、。D.1 病毒RNA的提取按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于-20保存、备用。D.2 PCR反应引物D.2.1 第一次反应引物上游引物序列（5-3）：GTGTAACACCTCTACAATGG下游引物序列（5-3）：ACAGTCTCYTCNGCCATCTD.2.2 第二次反应引物上游引物序列（5-3）：CAAGATGTGYGCYAAYTGGAG下游引物序列（5-3）：AGCCCTGGTTCGAACATTCT（简并引物，其中Y=C/T，N=A/C/G/T）D.3 反转录使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备cDNA。D.4 PCR反应条件D.4.1 第一次PCR反应条件以制
21、备的cDNA为模板，进行第一次PCR反应，条件如下：95预变性5min；95变性30s，56退火30s，72延伸30s，30个循环；72延伸2min。D.4.2 第二次PCR反应条件以第一次PCR产物为模板，进行第二次PCR反应，条件如下：95预变性5min；95变性30s，56退火30s，72延伸30s，30个循环；72延伸2min。D.5 PCR产物C.5.1 产物大小239bp。D.5.2 产物参考序列CAAGATGTGCGCTAACTGGAGTACCATCCCGAACTTTAGATTCTTAGCTGGAACCTACGACATGTTTTTCTCTCGGATTGAGCATTTGTACTCA
22、GCTATAAGAGTGGGCACAGTTGTCACTGCTTATGAAGACTGCTCAGGGTTGGTATCGTTCACAGGGTTCATAAAGCAAATAAATCTCACCGCGAGAGAGGCAATCCTATATTTCTTCCACAAGAACTTTGAGGAAGAAATAAGAADB23/ *20*10附录E（规范性附录）猫传染性腹膜炎病毒RT-PCR检测方法采用RT-PCR方法，特异性扩增猫传染性腹膜炎病毒ORF1b基因片段，用于猫传染性腹膜炎病毒的检测。E.1 病毒RNA的提取按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于-20保存、备用。E.2 PCR反应引物上游引物序列
23、（5-3）：GTGATGCTATCATGACTAG下游引物序列（5-3）：CACCATTACAACCTTCTAAE.3 反转录使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备cDNA。E.4 PCR反应条件95预变性2min；95变性30s，48退火35s，72延伸45s，30个循环；72延伸5min。E.5 PCR产物E.5.1 产物大小417bp。E.5.2 产物参考序列GTGATGCTATCATGACTAGGTGTCTTGCTATATATGATTGTTTTGTCAAACGTGTAGATTGGTCCATTGTGTACCCTTTTATTGAAAATGAAGAGAAGATCAATAAAGCTGGT
24、CGCATTGTACAATCACATGTCATGAGAGCTGCTCTTAAAGTTTTCAACCCTGCTGCAATTCACGATGTTGGTAATCCAAAAGGTATTCGTTGTGCTGCGACACCCATACCGTGGTTTTGTTATGACCGTGATCCTATTAATAACAATGTTAGATGTCTGGAGTATGATTACATGGTACATGGACAAATGAATGGTTTAATGTTGTTTTGGAATTGTAACGTAGACATGTACCCAGAGTTCTCAATTGTCTGTAGATTTGATACTCGGACCCGCTCAAAATTGTCATTAGAAGGTTGTAAT
25、GGTGDB23/T *201711附录F（规范性附录）猫白血病病毒巢式RT-PCR检测方法采用巢式RT-PCR方法，特异性扩增猫白血病病毒基因片段，用于猫白血病病毒的检测。F.1 病毒RNA的提取按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于-20保存、备用。F.2 PCR反应引物F.2.1 第一次反应引物上游引物序列（5-3）：ACAGCAGAAGTTTCAAGGCC下游引物序列（5-3）：GACCAGTGATCAAGGGTGAGF.2.2 第二次反应引物上游引物序列（5-3）：GCTCCCCAGTTGACCAGAGT下游引物序列（5-3）：GCTTCGGTACCAAACCGAAAF
26、.3 反转录使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备cDNA。F.4 PCR反应条件F.4.1 第一次PCR反应条件以制备的cDNA为模板，进行第一次PCR反应，条件如下：95预变性2min；95变性45s，58退火30s，72延伸1min，35个循环；72延伸7min。F.4.2 第二次PCR反应条件以第一次PCR产物为模板，进行第二次PCR反应，条件如下：95预变性2min；95变性45s，58退火30s，72延伸1min，35个循环；72延伸7min。F.5 PCR产物F.5.1 产物大小601bp。F.5.2 产物参考序列GCTCCCCAGTTGACCAGAGTTCGACCTTCC
27、GCCTCATTTAAACTAACCAATCCCCATGCCTCTCGCTTCTGTACGCGCGCTTTCTGCTATAAAACGAGCCATCAGCCCCCAACGGGCGCGCAAGTCTTTGCTGAGACTTGACCGCCCCGGGTACCCGTGTACGAATAAACCTCTTGCCGATTGCATCTGACTCGTGGTCTCGGTGTTCCGTGGGCGCGGGGCCTCATCGCCGAGGAAGACCCAGTTCGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATAGAGACCCCCAACCCCCGGGACCACCGACCCACCATCAGGAGGTAAGCTGG
28、CCGGCGACCATATCTGTTGTCCTTGTATAAGTGTCTCTGTCAATTGATCTGATTTTGGCGGTGGGATCGAAGGAGCTGACGAGCTCGTACTTCGCCCCCGCAACCCTGGAAGACGTTCCACGGGTGTCTGATGTCTGGAGCCTCTAGTGGGACAGCCATTGGGGCTCATCTGTTTGGGGTCTCACCTGAATACAGGGTGTTGATCGGAGACGAGGGAGCCGGACCCTCAAAGTCTCTTTCTGAGGTTTCATTTTCGGTTTGGTACCGAAGCDB23/ *20*12附录G（规范性附录）猫免疫缺陷病毒
29、巢式RT-PCR检测方法采用巢式RT-PCR方法，特异性扩增猫免疫缺陷病毒pol基因片段，用于猫免疫缺陷病毒的检测。G.1 病毒RNA的提取按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于-20保存、备用。G.2 PCR反应引物G.2.1 第一次反应引物上游引物序列（5-3）：TGGCCWYTAWCWAATGAAAARATWGAAGC下游引物序列（5-3）：GTAATTTRTCTTCHGGNGTYTCAAATCCCCG.2.2 第二次反应引物上游引物序列（5-3）：TGAAAARATWGAAGCHTTAACAGAMATAG下游引物序列（5-3）：GTAATTTRTCTTCHGGNGTYTC
30、AAATCCCCG.3 反转录.使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备cDNA。G.4 PCR反应条件G.4.1 第一次PCR反应条件以制备的cDNA为模板，进行第一次PCR反应，条件如下：95预变性2min；95变性45s，58退火30s，72延伸1min，35个循环；72延伸7min。G.4.2 第二次PCR反应条件以第一次PCR产物为模板，进行第二次PCR反应，条件如下：95预变性2min；95变性45s，58退火30s，72延伸1min，35个循环；72延伸7min。G.5 PCR产物G.5.1 产物大小578bp。G.5.2 产物参考序列TGAAAAAATTGAAGCCTTAA
31、CAGAAATAGTAGAAAGACTAGAAAGAGAAGGGAAAGTAAAAAGAGCAGATCCAAATAATCCATGGAATACACCAGTATTTGCTATAAAAAAGAAAAGTGGAAAATGGAGAATGCTCATAGATTTTAGAGAATTAAACAAACTAACTGAGAAAGGAGCAGAGGTCCAGTTGGGACTACCTCATCCTGCTGGTTTACAAATAAAAAAACAAGTAACAGTATTAGATATAGGGGATGCATATTTCACCATTCCTCTTGATCCAGATTATGCTCCTTATACAGCATTTACTTTACCTAGAAAAA
32、ATAATGCGGGACCAGGAAGGAGATTTGTGTGGTGTAGTCTACCACAAGGCTGGATTTTAAGTCCATTGATATATCAAAGTACATTAGATAATATAATACAACCTTTTATTAGACAAAATCCTCAATTAGATATTTACCAATATATGGATGACATTTATATAGGATCAAATTTAAGTAAAAAGGAGCATAAAGAAAAGGTAGAAGAATTAAGAAAATTACTATTATGGTGGGGATTTGAAACTCCAGAAGATAAATTACDB23/T *201713附录H（规范性附录）猫血巴尔通体PCR检测方法采用PCR
33、方法，特异性扩增猫血巴尔通体16S rDNA基因片段，用于猫血巴尔通体的检测。H.1 DNA的提取按照DNA提取试剂盒操作方法进行，提取的DNA于-20保存、备用。H.2 PCR反应引物上游引物序列（5-3）：TCACAATGGACGAAAGTCTG下游引物序列（5-3）：CCAAACATCTCAAGACACGAGH.3 PCR反应条件以提取的DNA为模板，进行PCR反应，条件如下：95预变性2min；95变性15s，55退火30s，72延伸1min，35个循环；72延伸5min。H.4 PCR产物H.4.1 产物大小711bp。H.4.2 产物参考序列TCACAATGGACGAAAGTCTG
34、ATGGAGCAATACCACGTGAACGATGAAGGTCTTCTGATTGTAAAGTTCTTTTATTTAGGAAAAAAAGCGCGCTAGGAAATGAGCGCGCCTTGATGGTACTAATTGAATAAGTGACAGCTAACTATGTGCCAGCAGCTGCGGTAAAACATAGGTCACGAGCATTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGAAGCGTAGGTGGGGAGGTTGATCCATTGTTAAAGGCATTTGCTTAACAAATGTGTGCGATGGAGATCGCCTCCCTAGAGTTAATCAGGGGGTACTGGAATTCAATGTGTAGCG
35、GTGGAATGCGTAGATATATTGAGGAACACCAGAGGCTAAGGCGAGTGCCTAGGATATAACTGACACTGAGGCTTGAAAGCGTGGGGAGCAAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGGCATTAGGTATTTGACATCTAGTCGAGTGCTGTAGCTAACGCGTTAAATGCCCCGCCTGGGTAGTATATATGCAAATATGAAACTCAAAGAAATTGACGGGGACCTGAACAAGTGGTGGAGCATGTTGCTTAATTCGATAATACACGAAAAACCTTACCAAGGCTTGCAATCTACTGCAAAGCTATAGAAATATAGTGGAGGCAATCAGTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCTTGAGATGTTTGG_
