1、ICS xxxxxxxxDB23黑 龙 江 省 地 方 标 准DB 23 XXXXX2016实验动物 牛微生物学等级及监测2017 - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施黑 龙 江 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB23/T *2017I目 录目录 .I前言 II1 范围 .12 规范性引用文件 .13 术语和定义 .24 微生物学等级分类 .25 检测要求 .26 检测程序 .47 检测方法 .48 检测规则 .69 结果判定 .610 判定结论 6附录 A .8附录 B 10附录 C 12附录 D 14DB23/ *2017II前 言本标准依据GB/T 1.1-2
2、009的编写规则起草。本标准由黑龙江省质量技术监督局提出。本标准由黑龙江省实验动物专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、黑龙江省标准化研究所、哈尔滨维科生物技术开发公司、黑龙江省百洲生物工程有限公司、东北农业大学。本标准主要起草人：于力、朱远茂、常继涛、宋莹、姜志刚、李昌文、赵丽丽、刘怀然、刘思国、杨艳坤、徐纯柱。DB23/T *20171实验动物 牛微生物学等级及监测1 范围本部分主要规定了实验动物 牛（以下简称实验牛）微生物学等级及监测的术语和定义、等级分类、检测要求、检测程序、检测方法、检测规则、结果判定等。本部分适用于实验牛微生物学等级监测。2 规范
3、性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 14922.2 实验动物 微生物学等级及监测GB 19489 实验室 生物安全通用要求GB/T 14926.46 实验动物钩端螺旋体检测方法GB/T 18637 牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术GB/T 18645 动物结核病诊断技术GB/T 18646 动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T 18653 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法GB/T 18935 口蹄疫诊断技术GB/T 22915 口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法GB/T 27
4、528 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法GB/T 27637 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB/T 27639 结核病病原菌实时荧光PCR检测方法GB/T 27981 牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法NY/T 539 副结核病诊断技术NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T 561 动物炭疽诊断技术NY/T 562 动物衣原体病诊断技术NY/T 574 地方流行性牛白血病琼脂凝胶免疫扩散试验方法NY/T 575 牛传染性鼻气管炎诊断技术SN/T 1086 牛生殖道弯曲杆菌病检疫技术规范SN/T 1087 Q热检疫技术规范SN/T 1088 布氏杆菌
5、检疫技术规范SN/T 1129 牛病毒性腹泻/黏膜病检疫技术规范SN/T 1315 牛地方流行性白血病检疫技术规范SN/T 1917 牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程SN/T 3392 国境口岸莱姆病螺旋体检疫规程DB23/ *20172SN/T 3741.1 国境口岸致病性钩端螺旋体PCR检测方法3 术语和定义GB/T 14922.2界定的以及下列术语和定义适用于本标准。3.1 实验牛经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检定以及其它科学实验的牛。3.2 普通级牛不携带所规定的重要人兽共患病和烈性传染病病原微生物的实验牛，
6、符合药典、兽药典等有关要求，可以免疫。3.3无特定病原体级牛除普通级应排除的病原微生物外，且不携带所规定的潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原微生物的实验牛，不可以免疫。用于疫病研究及生物制品研发、生产与检验的实验牛，除符合上述各项规定外，还应无特别规定的特异性病原和抗体，符合特别规定的有关要求。4 微生物学等级分类实验牛微生物学等级分为普通级和无特定病原体级。5 检测要求5.1 病原微生物检测项目各等级实验牛病原微生物检测项目见表1。DB23/T *20173表 1 实验牛微生物学检测项目等级 病原微生物 检测要求口蹄疫病毒 Food-and-mouth disease virus布鲁
7、氏菌 Brucella必须检测牛分枝杆菌 Mycobacterium bovis 必须检测炭疽芽胞杆菌 Bacillus anthracis钩端螺旋体 Leptospira普通级伯氏疏螺旋体 Borrelia burgdorferi必要时检测牛传染性鼻气管炎病毒 Infectious bovine rhinotracheitis virus牛病毒性腹泻/粘膜病毒 Bovine viral diarrhea virus/mucosal disease virus牛副流感病毒 3 型 Bovine parainfluenza virus type 3牛呼吸道合胞体病毒 Bovine respira
8、tory syncytial virus牛轮状病毒 Bovine rotavirus牛白血病病毒 Bovine leukemia virus副结核分枝杆菌 Mycobacterium avium Subsp. paratuberculosis胎儿弯曲杆菌 Campylobacter fetus 牛荚膜 A、B 型多杀性巴氏杆菌 Bovine pasteurellamultocida capsular type A and type B贝氏柯克斯体 Coxiellaburnetii无特定病原体级衣原体 Chlamydia必须检测5.2 检测项目分类5.2.1 必须检测项目DB23/ *20174
9、在进行实验动物牛质量评价时必须检测的项目。5.2.2 必要时检测项目申请生产许可证、从省外或国外引进实验动物牛、疑有该病原体感染和实验特殊需要时应检测的项目。普通级牛规定的必要时检测项目，在无特定病原体级牛中为必须检测项目。6 检测程序检测程序见图 1。采集鼻拭子、咽喉拭子、肛拭子（或新鲜粪便）*采集耳后、背部毛发或皮屑采血检测结果判定判定结论编号外观检查保定图 1 检测程序DB23/T *201757 检测方法检测方法见表 2.表 2 实验牛病原微生物检测方法检测方法微生物检测标准 适用范围GB/T 18935 抗体检测 1、抗原检测（食道喉部分泌物） 2、核酸检测（组织）GB/T 2291
10、5 核酸检测(血样、咽喉拭子)口蹄疫病毒GB/T 27528 核酸检测（水泡液）GB/T 18646 抗体检测（血清或奶样）布鲁氏菌SN/T 1088 核酸检测（阴道拭子、奶样、组织）GB/T 18645 皮内变态反应试验、抗原检测（血样、奶样、粪便或病料）牛分枝杆菌GB/T 27639 核酸检测（血样、奶样、粪便或病料）炭疽芽胞杆菌 NY/T 561 抗原检测（血液、病变部位的水肿液或渗出液）核酸检测（血液、病变部位的水肿液或渗出液）GB/T 14926.46 抗体检测钩端螺旋体SN/T3741.1 抗原检测（血液、尿液、组织）伯氏疏螺旋体 SN/T 3392 抗体检测、抗原检测（血样或蜱
11、3） 、核酸检测（血样或蜱）贝氏柯克斯体 SN/T 1087 抗体检测抗原检测（阴道分泌物、奶样、粪便、动物组织或流产胎儿）GB/T 27981 核酸检测（血样、结膜/黏膜拭子、精液及动物组织）牛传染性鼻气管炎病毒 NY/T 575 抗体检测、抗原检测（鼻拭子、阴道拭子、精液及组织）GB/T 18637 抗体检测、抗原检测（血样、鼻拭子、精液或动物组织）牛病毒性腹泻-粘膜病病毒 SN/T 1129 核酸检测（血样、鼻拭子、精液或动物组织）牛副流感病毒 3 型 附录 A 核酸检测（鼻拭子、肺组织）牛荚膜 A、B 型多杀性巴氏杆菌 附录 B 核酸检测（鼻拭子、肺组织）GB/T 27637 核酸检测
12、（血样、奶样、粪便或病料）副结核分枝杆菌NY/T 539 抗体检测（血清或奶样） 、抗原检测（粪便、病料） 、皮内变态反应GB/T 18653 抗原检测（阴道粘液、包皮液、精液）胎儿弯曲杆菌SN/T 1086 核酸检测（阴道粘液、包皮液、精液、流产胎儿或胎盘）牛呼吸道合胞体病毒 附录 C 核酸检测（鼻拭子、肺组织）牛轮状病毒 附录 D 核酸检测（肛拭子、新鲜粪便）NY/T 574 抗体检测SN/T 1315 抗原检测（血样）牛白血病病毒SN/T 1917 核酸检测（血样、动物组织）DB23/ *201768 检测规则8.1 检测频率每六个月至少检测一次。8.2 抽样8.2.1 方式选择六月龄以
13、上的实验牛用于检测（也可根据需求抽样），随机抽样。8.2.2 数量根据实验牛群体大小，抽样数量见表3。建议根据不同的感染情况和生物统计学意义等计算实际的抽样数量，但最低数量不得低于表3要求。表3 抽样数量群体大小 抽样数量小于20头 不少于5头21100头 不少于10头101500头 不少于20头大于500头 不少于30头8.2.3 方法8.2.3.1 可按病毒、细菌、真菌、寄生虫检测要求联合采样。8.2.3.2 釆集血液及毛发、皮屑、鼻拭子、咽拭子、肛拭子（或新鲜粪便）的方法参照NY/T 541 进行。8.2.3.3 检测结果存疑，需要进一步确诊时，应结合临床症状和前期检测结果，按照表 2中
14、的要求采集动物组织或特定样本，以做进一步检测。8.3 样本要求样本要有明显标识，写明检品名称、品系、等级、数量及检测项目等内容，安全送达实验室。涉及疑似人畜共患病的病料，按照生物安全规定执行。9 结果判定9.1 抗体检查免疫项目，群体免疫合格率大于等于70%，判为合格。非免疫项目，血清抗体阴性判为合格。衣原体 NY/T 562 抗体检测、抗原检测、核酸检测（流产胎儿或病料）注1：如无注明，用于抗体检测的样本均为血清。注2：抗原检测、核酸检测后“（）”中注明的是可用于检测的样本来源。注3：蜱是伯氏疏螺旋体的传播媒介。DB23/T *201779.2 病原和核酸检测未见阳性结果为合格。10 判定结
15、论在检测的各等级动物中，如有某项指标不符合该等级标准指标要求，则判为不符合该等级标准。DB23/ *20178附录A（规范性附录）牛副流感病毒3型RT-PCR诊断方法A.1检测原理流行病学调查显示我国牛副流感病毒 3 型血清阳性率达 77.96%（2960/3797） ，我国对牛副流感病毒 3 型未进行免疫接种，高血清阳性率说明我国牛群中感染非常普遍。运输、气候变化、混群等应激因素可导致牛副流感病毒 3 型的感染，作为实验牛经历运输等应激因素是必然的。牛感染牛副流感病毒 3 型后不但引起牛呼吸道疾病，还可引起免疫抑制，感染后不宜作为实验牛。本方法采用 RT-PCR 扩增牛副流感病毒 3 型高度
16、保守性 M 基因，实现牛副流感病毒 3 型的检测，达到筛选牛副流感病毒 3 型阴性实验牛的目的。A.2检测样本牛鼻腔深部拭子。A.3检测引物BPIV3 MF 5CCG CAA TAT ACA CAT TTC CAG-3BPIV3 MR 5GTA ATA TCT GAA CTC ACC GGG-3A.4检测方法鼻拭子加入一定量的 PBS，漩涡震荡后，3000 rpm 离心 5 min，取上清液。按照AXYGEN 病毒 RNA 小量提取试剂盒说明书方法提取基因组 RNA。以提取的基因组 RNA为模板，将其反转录为 cDNA。取 7.5 l 基因组 RNA，加入 1 l BPIV3 MF（4 mol
17、/L） 、以及 6 l dNTP（2.5 mmol/L） ，65 保温 5 min 后迅速在冰浴上冷却 2 min 以上。离心数秒使混合物集于管底。在上述混合物中加入如下物质，4 l 5M-MLV Buffer、1 l M-MLVRTase（200 U/l） 、0.5 l RNase inhibitor（40 U/l） 。56 作用 60 min，75 保温15 min。然后冰浴冷却后作为 PCR 反应模板备用。PCR 反应体系为 1.0 l Ex Taq（5 U/l） 、5 l 10Ex Taq Buffer、5 l dNTP（2.5 mmol/L） 、2 l 反转录产物、上下游引物 (10
18、 mol/l)各 1 l，加水至 50 l。反应条件为 95 3 min；94 45 s，60.5 45 s，72 1 min，30个循环；72 10 min。预计产物大小为 998 bp。同时设牛副流感病毒 3 型作为阳性对照和水作为阴性对照。PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。A.5结果判定阴阳性对照成立的条件下，样本能扩增出特异性大小约 998 bp 的目的条带判为阳性，否则判为阴性。A.6检测序列CCGCAATATACACATTTCCAGAATCTTCATTTTCTGAAAGTGGCAATATAGAGCCACTACCACTAAAGGTCAACGAACAAAGGAAGGCAATT
19、CCTCATATCAGAGTTGTTAAAATAGGTGACCCACCCAAACATGGTTCAAGATATCTTGATGTATTTCTACTGGGTTTTTTTGAGATGGAGCGGTCAAAGGACAGATATGGGAGTGTCAGTGATCTGGATGATGATCCAAGTTATAAAGTCTGTGGTTCTGGATCTCTACCACTTGGGCTAGCAAAATACACTGGGAATGATCAGGAACTCCTACAAGCCGCAATTAAGTTAGATATAGAAGTGAGAAGAACTGTCAAAGCCACGGAGATGATAGTCTACACCGTGCAGAACATTAAACCT
20、GAACTGTACCCATGGTCAAGCAGATTAAGAAAAGGGATGTTATTTGACGCCAACAAAGTTGCGCTTGCACCCCAGTGTCTTCCACTCGATAGAGGGATAAAATTCAGAGTAATATTTGTGAATTGTACAGCAATTGGATCAATAACACTCTTTAAAATTCCCAAATCTATGGCTTTGCTATCATTGCCAAACACCATATCAATAAACTTACAGGTACACATAAAAACAGGAATCCAAACTGDB23/T *20179ACTCTAAGGGGGTTGTCCAGATCTTAGATGAGAAAGGTGAGAAATC
21、GTTAAACTTTATGGTCCATCTTGGATTAATTAAACGGAAGGTAGGTCGAATGTATTCAGTAGAGTATTGCAAACAAAAGATTGAGAAGATGAGACTACTATTTTCATTGGGATTAGTTGGAGGAATTAGCTTTCATGTCAATGCAACTGGGTCTATTTCGAAGACGTTGGCGAGTCAACTAGCGTTCAAAAGGGAAATCTGTTATCCTCTCATGGATTTAAACCCACACCTAAATCTGGTTATATGGGCATCATCAGTTGAAATCACAAGAGTGGATGCAATCCTTCAACCTTCATTGCC
22、CGGTGAGTTCAGATATTACDB23/ *201710附录B（规范性附录）牛荚膜A、B型多杀性巴氏杆菌多重PCR诊断方法B.1检测原理牛多杀性巴氏杆菌为典型的条件致病菌，自然条件下常寄生于牛上呼吸道，在受到应激刺激后可引起牛体发病。实验牛不可避免地受到运输等应急因素的刺激而增加发病风险，从而对其它实验造成不利影响，所以实验牛排除该病很有必要。我国主要流行荚膜 A、B两种血清型的多杀性巴氏杆菌。本方法通过对采集的牛鼻腔拭子进行多重 PCR 的检测，采用特异性引物分别扩增多杀性巴氏杆菌种特异性基因 kmt1，以及 A、B 荚膜血清型特异性基因 hyaD-hyaC 与 bcbD，实现多杀性
23、巴氏杆菌检测并分型，达到筛选牛荚膜 A、B 型多杀性巴氏杆菌阴性实验牛的目的。B.2检测样本牛鼻腔深部拭子，置于脑心浸液培养基中(含万古霉素 10g/ml)培养后，收获细菌。B.3检测引物多杀性巴氏杆菌种特异性基因 kmt1（460bp）上下游引物序列：kmt1-U：5ATC CGC TAT TTA CCC AGT GG 3;kmt1-L：5GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC 3;荚膜血清 A 型特异性基因 hyaD-hyaC（1044bp）上下游引物序列：CAPA-U: 5 TGC CAA AAT CGC AGT CAG TAT TTT TTA TCC 3CAPA-L: 5
24、 TGC CAT CAT TGT CAG TGA TTT ATT TTG TAA G 3荚膜血清 B 型特异性基因 bcbD（760bp）上下游引物序列：CAPB-U: 5GCG ATA TCA ATC TGC TTA AGA TAA T 3;CAPB-L: 5GAG GAT TCT ATC TTG ACT GAA GTA 3。B.4检测方法按照 AXYGEN 病毒 DNA 小量提取试剂盒说明书方法提取培养物 DNA。配制下列PCR 反应体系，DNA 模板 500 ng，多重上游引物（10 M）1.5 l，多重下游引物（10 M）1.5 l，2Taq PCR MasterMix 12.5 l，
25、ddH 2O 补至 25 l，同时设多杀性巴氏杆菌作为阳性对照和水作为阴性对照。95预变性 5 min；94 30 s，55 30 s，72 70 s，共 30个循环；72延伸 10 min。PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。B.5结果判定阴阳性对照成立的条件下，同时扩增出多杀性巴氏杆菌种特异性基因 kmt1（460 bp）片段和荚膜血清 A 型特异性基因 hyaD-hyaC（1044 bp）片段的，判定为牛多杀性巴氏杆菌荚膜 A 型阳性；同时扩增出多杀性巴氏杆菌种特异性基因 kmt1（460 bp）片段和荚膜血清B 型特异性基因 bcbD（760 bp）片段的，判定为牛多杀性巴氏杆
26、菌荚膜 B 型阳性。B.6检测序列Kmt1TGCTGTAAACGAACTCGCCACTTTTTGTTTCATTTGGACTGACACGATCAAACCGTTGAACACGAAGAAAAAGACCAAAATAGGTAACCAATACACGATAAATAAATTAAACCGCTCTACCGTTAATGGCTTCAATAATGGCCATAAGAAACGTAACTCAACATGGAAATATTGATAAATCAGACTGACAAGGAAATATAAACCGGCAAATAACAATAAGCTGAGTAATAAATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCAAGGAAGCAGATTGGCTCAA
27、CACACCAAACTCTGCCCAACAAAACTGTGCTTTTCTTTGCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCGDB23/T *201711ACAAGCCCACTCACAACGAGCCATAAAATAATGCCATTTCCCATTTCAAGTGGCATAAAACTCAATTTCGCGGCAATCGGTTCATTCGCACCGCCCCACTGGGTAAATAGCGGATAAhyaD-hyaCTGCCAAAATCGCAGTCAGTATTTTTTATCCCAATACATTAAACGGCTTAGTGAAAAAACTAAACAATATTATTGAATATAATAAAAATATATTCGT
28、TATTGTTCTACATGTTGATAAGAATCATCTTACACCAGATATCAAAAAAGAAATACTAGCCTTCTATCATAAACATCAAGTGAATATTTTACTAAATAATGATATCTCATATTACACGAGTAATAGATTAATAAAAACTGAGGCGCATTTAAGTAATATTAATAAATTAAGTCAGTTAAATCTAAATTGTGAATACATCATTTTTGATAATCATGACAGCCTATTCGTTAAAAATGACAGCTATGCTTATATGAAAAAATATGATGTCGGCATGAATTTCTCAGCATTAACACATGATTG
29、GATCGAGAAAATCAATGCGCATCCACCATTTAAAAAGCTCATTAAAACTTATTTTAATGACAATGACTTAAAAAGTATGAATGTGAAAGGGGCATCACAAGGTATGTTTATGACGTATGCGCTAGCGCATGAGCTTCTGACGATTATTAAAGAAGTCATCACATCTTGCCAGTCAATTGATAGTGTGCCAGAATATAACACTGAGGATATTTGGTTCCAATTTGCACTTTTAATCTTAGAAAAGAAAACCGGCCATGTATTTAATAAAACATCGACCCTGACTTATATGCCTTGGGAACG
30、AAAATTACAATGGACAAATGAACAAATTGAAAGTGCAAAAAGAGGAGAAAATATACCTGTTAACAAGTTCATTATTAATAGTATAACTCTATAAAACACTTGCATTTTATTAAAAATAAAATCCTATAATATTTGCAGTTTAAATAAAGGATAAAAAATGAAGAAAATTACAATTGCTGGGGCTGGCTATGTTGGTTTATCCAATGCAGTATTATTAGCTCAACACCACAATGTGATCTTATTAGATATTGATCAAAATAAAGTTGATTTAATTAATAATAAAAAATCGCCCATCACAGA
31、TAAAGAAATCGAAGATTTCTTACAAAATAAATCACTGACAATGATGGCAbcbDGCGATATCAATCTGCTTAAGATAATTGCTATCTTTAATGAATAACGCAAATAAATAATTAACGATTTCTAGTTTTACCAAAATAAAGTTCAACTGTGTTTGAGAACACTTTTTTAAAATGAGTAGTATTTCCTCTGGTGGAGCTTGGATAAATGAGGAGGGGGCAAAATAAGCTACATTAACATTAAAAGTCAGATCTCTAGGCTCAAACTTCCAATCATTTTTCACGAGAAATTCATCCAAGGCAG
32、CTGCAACATTCTTCCAGCTACCCCACGGTAAACCAGCAGAGTCGTTATAACGAGTAACGCTAATCAAATCACTACGTTGAAACTGTTCAAGTAACGCATCCACACTCAGTTGCTTCTCTGCAATGAGTTTTTCAATATTTGTTTGTGAGAAAATAATTTTATGCATTATTTACGCCTTTACTATTATATTTTGTGTTCAACAGAGAGTTAACAGCCTCCAAAATCTCATCTAACTGGTGCATATCTGCTTTGAGTAAACGATCGTTTTCAATGTGACTCATCGGACTGTCTTGCTCGGTC
33、AGTGCTAAAATTAAAGAAGCGGATCCTAAGTAATCGCTCAATTTTGATGGTAAGTAAGGATTATTCATTTTTAGTTCTTTGGTTTGCGTGTCCATCACAATCAGACCATCAAATTGATCCGCTAATGCTAGAAAATCAAAGTAAGCTACATATTTTTGGATAACAATCTGTGCTCTAATTTCCTCCGGTACTTCAGTCAAGATAGAATCCTCDB23/ *201712附录C（规范性附录）牛呼吸道合胞体病毒套式RT-PCR检测方法C.1检测原理自 2008 年以来，我国牛群爆发严重的呼吸道疾病，表现为牛呼吸道疾病综合
34、征，抗生素治疗效果不明显，发病率高，死亡率高，给养牛业带来极大的经济损失。病原流行病学调查显示存在多病原感染，其中主要原发病因为病毒性病原，包括牛呼吸道合胞体病毒等。本方法采用 RT-PCR 方法，扩增呼吸道合胞体病毒高度保守性核酸，实现牛呼吸道合胞体病毒的检测，达到筛选牛呼吸道合胞体病毒病阴性实验牛的目的。C.2检测样本牛鼻腔深部拭子C.3检测引物引物名称 引物序列 扩增产物片段（bp）1U25： 5ACGCGAAAAAATGCGTATAACAAAC 38749U25： 5AATTCGTAGAGCTATAGAAATAAGT 310262L25： 5TCCTACCTACACTAAGTTCTCT
35、TTC 3 15388785U23： 5ATATGCTATATTGAACAAATTGG 310215L23： 5GTTTGGATTATTAAGATATTCCT 3 1453C.4检测方法牛鼻腔深部拭子或肺组织研磨后加入一定量的 PBS，漩涡震荡后， 3000 rpm 离心 5 min，取上清液。按照 AXYGEN 病毒 RNA 小量提取试剂盒说明书方法提取基因组 RNA。用 1U25 引物进行反转录，反应条件为 25 10 min，42 60 min；在用 8749 U25 和 10262 L25 引物进行第一轮 PCR 扩增；然后再以第一轮 PCR 产物为模板，用 8785 U23 和 10
36、215 L23 引物进行第二轮 PCR 扩增。同时设牛呼吸道合胞体病毒作为阳性对照和水作为阴性对照，反应条件为 94 预变性 4 min，然后 94 45 s、55 45 s、72 1.5 min 共 30 个循环，最后 72延伸 10 min。PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。C.5结果判定在阴阳对照成立的条件下，第一轮或第二轮 PCR 扩增出现 1500 bp 左右的特异性目的条带，则判为牛呼吸道合胞体病毒阳性。C.6检测序列AATTCGTAGAGCTATAGAAATAAGTGATGTCAAAGTATATGCTATATTGAACAAATTGGGTTTAAAAGAAAAGGGAAA
37、AGTTGATAGATGTGATGACACTAACACAACGCTATCTAACATAGTAAGAGATAATATACTCTCAGTCATAAGTGACAATACTCCCAGTACTAAAAAACCAAATAATTCATCGTGTAAACCAGATCAGCCAATTAAAACAACAATTTTATGCAAGCTTTTAAGTTCGATGAGTCATCCCCCTACATGGTTAATACATTGGTTTAATTTATACACAAAATTAAATGACATCTTGACCCAATACAGAACAAATGAAGCAAGAAATCATGGTTACATACTTATAGATACTAGAACCTTGGGTGA
38、ATTCCAATTTATATTAAATCAATATGGTTGCATTGTATATCATAAGAAATTAAAGAAAATTACAATCACCACATATAATCAATTTCTAACATGGAAAGACATTAGCCTCAGTAGATTAAATGTTTGTATGATCACCTGGATAAGCAATTGTTTAAATACCTTGAATAAAAGCCTTGGATTGAGATGTGAGTTTAACADB23/T *201713ATGTCACTCTATCTCAATTATTCCTTCATGGGGATTGTATATTGAAATTATTTCATAATGAAGGTTACTATATTATAAAAGAAGTTGAA
39、GGTTTTATAATGTCATTAATTTTGAACCTAACGGAAGAAGATCAATTCAGAAAAAGATTCTTCAACAGTATGCTAAATAATATTACAGATGCTGCAGCAAGAGCTCAACAAGATTTATTATCAAGAGCCCGCCATACTATATTAGACAAAACAATATCAGATAACATATTAAATGGTAAATGGTTAATTTTATTAGGTAAGTTTCTTAAATTGATTAAATTAGCTGGTGCTAATAATCTTAATAACCTAAGTGAACTCTACTTTCTCTTTAGAATATTTGGACATCCCATGGTAGATGAA
40、CGGCAAGCAATGGATGCTGTGAGATTAAACTGTAATGAAACTAAATTTTACTTATTGAGTAGCCTTAGCATGTTAAGAGGTGCATTCATTTATAGAATTATAAAGGGATTTGTAAACACATATAATAGGTGGCCTACCTTAAGGAATGCTATAGTTTTACCCTTAAGATGGATAAATTACTACAAACTCAATACTTACCCATCATTATTAGAATTAACAGAAGCTGATTTGATTATATTGTCTGGACTGAGATTTTATAGAGAATTCCATCTACCGAAAAAAGTAGATTTAGAAGTCATA
41、ATAAATGATAAAGCAATATCACCTCCCAAAAACCTTATCTGGACCAGTTTTCCCAAAAACTATATGCCATCACACATACAGATTTACATAGAACATGAAAGACTAAAGTTTACTGAGAGTGATAGATCTAGAAGGGTTCTGGAATATTATTTAAGGAATAATAGATTCAGTGAGAGTGACCTATATAACTGTATAGTAAACCAGGAATATCTTAATAATCCAAACCATGTAATATCATTAACAGGAAAAGAAAGAGAACTTAGTGTAGGTAGGADB23/ *201714附录D（规范性附录）牛轮状
42、病毒多重半套式RT-PCR检测方法D.1检测原理牛轮状病毒是引起犊牛腹泻的最主要病原，发病率可高达 50%-100%，7 日龄以内犊牛最为易感，典型症状为严重腹泻，粪便呈水样，色呈淡黄色，有时混有钻液和血液，犊牛脱水，眼凹陷，四肢无力，消瘦，卧地，感染后不适合作为实验牛。本方法以牛轮状病毒的核酸为检测靶标，采用 RT-PCR 方法对样品中的核酸进行数量级扩增，最终在琼脂糖凝胶上形成肉眼可见核酸条带，从而实现对待检样品中目标病毒的检测。再在不同基因型高度变异区设计一条特异性引物，该引物仅对一个基因型反应，而不与其他基因型反应，结合一条适合该病毒检测的通用引物，采用多重半套式 RT-PCR，实现基
43、因型的鉴定，达到筛选牛轮状病毒阴性实验牛的目的。D.2 检测样本新鲜粪便或肛拭子D.3 检测引物引物名称 引物序列 扩增产物片段（bp）VP7-F ： 5 GGCTTTAAAAGCGAGAATTTCC 3VP7-R： 5 GGTCACATCATACAACTCTAAT 3 1062G5-2： 5 CATGTACTCGTTGTTACGTC 3 780G6-2： 5 CTAGTTCTTGTGTAGAATC 3 500G10-2： 5 TTGAGCCGTTGCGACTTC 3 715G8-2： 5 CGGTTCCGGATTAGACAC3 273G9-2： 5 TTATAAAGTCCATTGCAC 3
44、148D.4 检测方法新鲜粪便或直肠拭子加入一定量的PBS，漩涡震荡后，3000 rpm离心5 min ，取上清液。按照AXYGEN病毒RNA小量提取试剂盒说明书方法提取基因组 RNA。用VP7-R 引物进行反转录，反转录条件为25 10 min，42 60 min；再用VP7-F和 VP7-R引物进行第一轮PCR。然后再以第一轮PCR产物为模板，用VP7-F与G5-R、G6-R 、G8-R 、G9-R和G10-R 多条引物进行多重半套式PCR，均设置牛轮状病毒作为阳性对照和水作为阴性对照，反应条件为94预变性4 min，然后94 45 s、55 45 s、72 1 min共30个循环，最后7
45、2延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。D.5 结果判定在阴阳对照成立的条件下。第一轮PCR 扩增出1062 bp的特异性目的条带，则判定牛轮状病毒阳性，但不能确定那个基因型。多重半套式PCR扩增出 780 bp特异性条带，则判定牛轮状病毒G5型阳性；500 bp 为G6型，715 bp为G10 型，273 bp为G8型，148 bp为G9型阳性。D.6 检测序列GGCTTTAAAAGCGAGAATTTCCGTTTGGCTAGCGGTTAGCTCCTTTTAATGTATGGTATTGAATATACCACAATTCTAATCTTCTTGACATCGATTACATTATTGAA
46、TTATATCTTADB23/T *201715AAATCAATAACGAGAATGATGGACTATATAATTTACAGATTTCTGCTTATAGTAGTGATCTTGGCCACCATAATAAATGCGCAAAACTATGGAGTAAATTTGCCAATTACAGGTTCAATGGATACTGCGTATGCAGACTCTACACAAAGTGAGCCATTTTTGACATCAACCCTTTGTTTGTATTATCCTGTTGAGGCATCAAACGAAATAGCTGATACCGAATGGAAAGATACCTTATCACAATTGTTCTTGACAAAAGGATGGCCAACAGGATCA
47、GTGTACCTTAAAGAATATGCTGATATAGCGGCCTTTTCAGTGGAACCACAGTTATACTGCGATTATAATTTAGTTTTAATGAAATATGATTCTACACAAGAACTAGATATGTCTGAATTGGCCGATCTTATATTGAACGAATGGCTGTGCAATCCAATGGACATAACGCTATATTATTATCAGCAGACTGATGAAGCAAATAAATGGATATCAACGGGCTCTTCTTGCACGGTTAAAGTGTGTCCATTAAATACACAAACACTTGGTATTGGATGTCTAATAACTAATCCAGACACGTTT
48、GAAACAGTTGCGACAATGGAGAAGTTAGTGATTACAGATGTTGTAGATGGTGTCAATCACAAATTAAACGTCACAACGGCAACGTGCACCATACGCAACTGTAAAAAGTTAGGACCAAGGGAGAACGTAGCAGTCATACAGGTAGGCGGCGCAAATGTTTTAGACATCACAGCTGATCCAACAACTACACCACAGACAGAGAGAATGATGCGAATAAATTGGAAAAAATGGTGGCAAGTGTTTTACACGGTAGTGGATTACGTCAATCAGATAATTCAGACAATGTCCAAAAGATCTAGATCGCTTAATTCGTCGGCGTTCTACTATAGAGTGTAGGTGCATGTTAGATTAGAGTTGTATGATGTGACC_
