1、ICS 65.150B 52备 案号 ： DB32江 苏 省 地 方 标 准DB32/T 17382011草 鱼 出 血 病 病 毒 （ GCHV） 逆 转 录 聚 合 酶 链 式 反 应 (RT-PCR)检 测 方 法Test method of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for Grass Carp Hemorrhage Virus(GCHV)2011-04-15 发布 2011-06-15 实施江 苏 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB32/T 17382011I前 言本 标 准 按 GB/T
2、 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准化的结构和编写规则的规定编写。 本标准的附录A为资料性附录。本 标准 由江 苏省 海洋 与渔 业局 提出 。 本 标 准 起 草 单 位 ： 江 苏 省 水 生 动 物 疫 病 预 防 控 制 中 心 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 陈 辉 、 邹 勇 、 李 婧 慧 、 段 翠 兰 、 方 苹 、 刘 训 猛 、 倪 金 俤 、 王 习 达 、 陈 静 、 陈 光 芸 、郭 立新 。DB32/T 173820111SC/T 7103-2008 水 生动 物产 地 检 疫采 样技 术规 范GB/T 15805-2008 鱼 类检 疫方
3、法GB/T 6682-2008 分 析实 验室 用 水 规格 和试 验方 法草鱼出血病病毒（ GCHV）逆转录 聚合酶 链式反应(RT-PCR)检测方法1 范 围本标准规定了细胞分离病毒后，用 PCR 技术诊断草鱼出血病病毒的方法。 本标准适用于草鱼出血病病毒的分离和鉴定，适用于本病的流行病学调查、诊断、检疫和检测。2 规范性引用文件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 部 分 。 凡 是不 注日 期的 引用 文件 ，其 最新 版本 （包 括所 有的 修改 单） 适用
4、于本 部分 。3 试剂和材料3.1 水应符合 GB/T 6682-2008中一级水的规格。用于 PCR(包括核酸抽提 )时所用的水要用 DEPC处 理以除掉RNA酶3.2 GCHV标准株3.3 Taq酶-20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.4 逆转录酶AMV10 U /m L。-20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.5 RNA抑制剂(RNasin)20 U /L。-20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.6 dNTP(含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10 mmoL/L) 3.7 引 物试验用到的一对引物，其扩增出的片段为455bp，其序列如下： F：5-CGC TTC G
5、CT GTT TAT GC-3R：5-TTA TCA GGT GCC CAG TTT T-3DB32/T 1738201123.8 无 水 乙 醇分析纯，使用前预冷到-20。3.9 矿物油要求无DNA酶和RNA酶。4 器材和设备4.1 96孔细胞培养板。4.2 倒 置 显 微 镜 。4.3 恒 温 培 养 箱 。4.4 普 通 冰 箱 和 低 温 冰 箱 。4.5 组织研磨工具。4.6 离 心 机 和 离 心 管 。4.7 PCR扩增仪。4.8 电 泳 仪 。4.9 微量移液器及吸头。4.10 凝胶成像系统。5 GCHV 病毒的分离5.1 采 样对 有 临 床 症 状 的 鱼 ， 如 是 体
6、长 小 于 等 于 4cm的 鱼 苗 取 整 条 鱼 ， 体 长 4cm 6cm的 鱼 苗 取 内 脏 (包 括 肾 ); 体 长 大 干 6cm的 鱼 则 取 脑 、 肝 、 肾 、 脾 。 而 对 无 症 状 的 鱼 要 取 肾 、 脾 、 鳃 和 脑 组 织 。 按 SC/T 7103-2008 采样。5.2 样 品 处 理应 在 10 以 下 。 先 用 组 织 研 磨 工 具 将 样 品 组 织 匀 浆 成 糊 状 ， 再 按 1:10的 最 终 稀 释 度 重 悬 于 培 养 液 中 . 如 果 在 匀 浆 前 未 用 抗 菌 素 处 理 过 样 品 ， 则 须 将 样 品 匀 浆
7、 后 再 悬 浮 于 含 有 100U/m L双 抗 （ 青 霉 素 、 链 霉 素 ） 的 培养 液中， 于 15下 孵育 2h-4h或 4下 孵育 6 h 24 h, 差 速离 心： 9000r/min 5min， 12000r/min 15min, 收 集上 清液 。5.3 病 毒 分 离对 1: 10 的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将这1:10,1:100和1:1000 3个稀释度的上清 液以适当体积分别接种到生长约 24 h的 CIK细胞单层中，每孔 (2cm2)的细胞单层最多接种 100L 稀释液。 15-20 吸附 0.5h lh后，加人细胞培养液。置于 24 士 1
8、培养。试验中要设有阳性对照 (接种 GCHV 标 准株 )， 和 空 白 对 照 (未 接 种 病 毒 的 细 胞 )。 阳 性 对 照 和 待 测 样 品 都 接 种 细 胞后 ， 7d内 每 天 用 40倍 到 100 倍 倒 置 显 微 镜 检 查 。 空 白 对 照 细 胞 应 当 正 常 。 如 果 接 种 了 被 检 匀 浆 上 清 稀 释 液 的 细 胞 培 养 中 出 现 细 胞病 变 (CPE)，应立即进行 PCR鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有 CPE出现，则在培养 7d后还要用敏感细胞 进行再传代培养。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以 700
9、0r/min,4 离 心 15min， 收 集 上 清液 。 将 上 清 液 接 种 到 新 鲜 细 胞 单 层 ， 培 养 7d。 每 天用 40倍 到 100倍 倒 置 显 微 镜检 查。如果阳性对照也未出现 CPE，则必须换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒学 检查。3DB32/T 173820116 操 作步 骤6.1 样 品 处 理将 450 L细 胞 病 变 悬 液 放 人 1.5ML的 离 心 管 ， 再 加 人 450 L CTAB溶 液 (见 附 录 A.1)并 混 匀 ， 25 作 用2h2.5h。6.2 RNA抽提在 含 有 样 品 的 塑 料 离 心 管
10、 中 加 人 600 L抽 提 液 1(见 附 录 A.2)， 用 力 混 合 至 少 30s， 12000r /min离心 5min， 小 心取 上层 水相 (约7 50L )， 再 加人 650 L抽 提液 2(见 附录A .3)， 用 力混 合至 少3 0 s, 12000 r/min 离心5 min， 小 心 取 上 层 水 相 约 600 L)。 再 加 入 -20 预 冷 的 1.5倍 体 积 的 无 水 乙 醇 (约 900 L)， 倒 置 数 次 混 匀后 ， -20 8h以 上 沉 淀 核 酸 。 14000 r/min离 心 30 min， 小 心 弃 去 上 清 。 干
11、澡 后 加 12L 水 溶 解 ，-80冻融一次，用作PCR模板。6.3 变性和退火在 PCR管 中 加 人 10 L模 板 和 1.5 L引 物 R， 加 3.5 L水 使 总 体 积 为 15 L,置 于 90 反 应 5min 10 min。立即冰浴，低速离心约5s，使液体集中在底部。6.4 cDNA合成在 上 述 反 应 管 中 继 续 加 入 ： 5 L的 5倍 逆 转 录 酶 浓 缩 缓 冲 液 (见 附 录 A.5) ,2L dNTP, 1L RNA酶 抑制剂(20 U),1L逆转录酶AMV(20U)和1L水。40反应 60min，再95 10 min灭活。6.5 PCR扩增DN
12、A在上述反应管中再继续加入：10倍Taq酶用浓缩缓冲液(见附录A.7 )9L,25mmol/L的氯化镁(见附 录A.6) 9L.,dNTP2L、引物R 1 L和 引 物 F 1L,Taq酶 1L、加水到总体积为100L,每管加入50 L矿 物 油 。 短 时 间 低 速 离 心 让 矿 物 油 集 中 在 上 层 。 再 将 反 应 管 置 于 PCR扩 增 仪 。 按 照 ： 94 4 min94 1 min57 1 min72 1.5 min 35次循环, 72 10 min4保温。6.6 琼脂糖电泳用TBE电泳缓冲液(见附录A.4 )配制1%的琼脂糖(含0.5g/mL EB见附录A.8)
13、平板。将平板放人水平 电 泳 槽 ， 使 电 泳 缓 冲 液 刚 好 淹 没 胶 面 将 6 L样 品 和 2 L样 品 缓 冲 液 (见 附 录 A. 9 )混匀后加入样品孔。 在电泳时设立DNA标准分子量作对照， 5V/cm电泳约0.5 h， 当 溴 酚 蓝 到 达 底 部 时 停 止 。 在 凝 胶 成 像 系 统 下观察核酸带并判断结果,结果图见图1。6.8 设 立 对 照6.8.1 在6.1样品处理过程中必须设立阳性对照、阴性对照和空白对照。6.8.2 取含有已知草鱼出血病病毒标准株的细胞悬液作为阳性对照。6.8.3 取正常的细胞悬液作为阴性对照。6.8.4 取等体积的水代替模板作为
14、空白对照。4DB32/T 17382011图 1 PCR结果图7 结 果判 定样 品 经 过 接 种 细 胞 和 盲 传 后 均 没 有 CPE出 现 ， 则 结 果 判 为 阴 性 。 有 CPE出 现 ， 则 要 用 PCR方 法 鉴 定 是 否 由草鱼出血病病毒引起。 PCR后阳性对照会出现一条 455bp的 DNA片段。阴性对照和空白对照没有该核酸 带。待测样品PCR扩增后能在相应455bp DNA位置上有带，可判为阳性。无带或带的大小不是455 bp判 为 阴性。5DB32/T 17382011附 录 A(资 料 性 附 录) 试 剂 配 制A.1 CTAB 溶 液按CTAB 2%，
15、氯化钠 1.4mol/L,EDTA 20mmol/L,Tris-HCL 20mmol/L pH=7.5 配 制 。 用 前 加 琉 基 乙 醇 至终浓度为0.25% 。A.2 抽提液 11mol/L Tris水溶液饱和的酚：三氯甲烷：异戊醇= 24：24：1 混 合 ， 密 闭 避 光 保 存 。A.3 抽提液 2将三氯甲烷/异戊醇按24:1的比例混合，密闭避光保存。A.4 TBE 电泳缓冲液(5 倍浓缩液)Tris 5.4 g硼 酸 27.5 gEDTA 2.922 g水 1000m L用 5 mol/L的盐酸调到pH 8。A.5 逆 转 录 酶 AMV 的 5 倍 浓 缩 缓 冲 液Tris-盐酸 250 mmol/L,pH8.3氯化钾 250 mmol/L氯化镁 50 mmol/LDTT 50 mmol/LA.6 25 mmol/L 氯化镁A.7 Taq 酶 用 10 倍 浓 缩 缓 冲 液Tris-HCL 500 mmol/L,pH 8.8氯化钾 500 mmol/LTritonX-100 1%A.8 EB(核酸染色剂)6DB32/T 17382011用水配制成10mg/ml的浓缩液。用时每10m L电泳液或琼脂中加1L。A.9 样品缓冲液每100 mL水溶液中含：溴酚蓝：25 g，蔗糖40 g。
