1、第四章 分子生物学常用技术,.核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。,1、萨瑟恩DNA印迹杂交根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.S
2、outhern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。,Southern 凝胶转移杂交技术,Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的psbA基因序列。,2、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）1979年，J.C.Alwin
3、e等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。,3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting ）是在Southern印迹杂交的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸（DNA
4、和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。,检测重组体克隆的菌落杂交技术,4、菌落杂交,核酸杂交常用几种膜的性能比较,. 蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术,1、凝胶阻滞实验（Gel retardation assay）又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质型胡作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的
5、一种典型的实验方法。,2、DNase足迹实验（footprinting assay）是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。,32p,1 5 10,*,1 4 8 10,*,加入蛋白质X,加入DNaseI凝胶电泳放射自显影,1,5,10,A B,足迹,
6、(a),(c),(b),DNaseI 足迹实验,3、甲基化干扰实验（methyltion interference assay）,根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。 DMS化学干扰的主要局限性时，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。 具体操作如
7、下页图所示。,甲基化干扰实验,应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验,5、Southwestern杂交6、Northwestern杂交,.PCR技术1、基因扩增原理条件,Reaction Condition for a Typical PCR Assay,Typical PCR Thermal Profile,*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length,Some DNA Polymerases Used in PCR,Characteristics of Taq Polymerase,2、PCR用于基因突变,3、PCR用于融合基因的克隆,.体外转录与体外翻译 1、体外转录系统,.基因瞬间表达与稳定表达,2、常用的体外翻译系统小麦胚、兔网织红血球,下节课讲,
