1、分子生物学常用检测技术 及临床应用,DNA四种核苷酸（A-T-C-G)组成的多聚骨架,所有组成DNA的核苷酸dATP,dTTP, dCTP,dGTP 都由三种成分组成： 1）一个2-脱氧核糖（戊糖） 2）一个含氮碱基嘌呤：AG 嘧啶：T/C 3）三个磷酸基团各单个核苷酸由5和3-碳形成的磷酸二酯键连接在一起,变性、复性、退火和淬火,基因,分子生物学常用技术,PCR（聚合酶链式反应）核酸分子杂交基因芯片技术(biochip)DNA 测序（DNA sequencing ）DNA重组技术(DNA recombination),一、聚合酶链反应 （Polymerase Chain Reaction ，
2、PCR）,体外基因扩增技术,特异性强 灵敏度高 操作简单、省时 对待检原始材料质量要求低 高效率的基因扩增技术,（一）PCR原理,原理 双链DNA 变性 退火 链延伸 （膜板） （双链分成单链） （膜板与引物杂交） （DNA合成）,不断重复,PCR反应体系,Mg2+,Mn2+,dCTP,dGTP,dTTP,dATP,Taq DNA 聚合 酶,模板,引 物,和或 和,（二）PCR反应的设计及影响因素,PCR的种类,荧光定量PCR 通用引物PCR 多重PCR 巢式PCR RT-PCR 原位PCR 免疫PCR ,TaqMan探针,荧光定量PCR,定量PCR的数学原理,PCR 理 论 方 程,N =
3、N0 x (1+E)n,N：扩增数量 N0：起始模板数量 E：扩增效率 N：循环数,定量PCR的数学原理,CT = - k logN0 + b,Ct （Cycle threshold）值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值（threshold）时所经历的循环数。,PCR的临床应用,对病原微生物核酸进行快速检测 弥补免疫检测的缺陷 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 用于药物疗效监测和评估 用于肿瘤基因表达方面的研究 用于遗传病的诊断,样本采集要求,二、核酸分子杂交,根据核酸变性和复性的原理，不同来源的变性单链核酸分子在合适的条件下，通过碱基互补形成双链杂交体的过程称为核酸分子杂交（mol
4、ecular hybridization）。,1、遗传病的诊断 2、病原体的鉴定 3、癌基因突变的检测 4、组织配型 5、亲子鉴定,核酸分子杂交的临床应用,三、基因芯片技术,基质材料分，有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等。,用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列,原位合成法在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列,基因芯片技术的应用,1、药物筛选和新药开发 2、疾病诊断 3、环境保护 4、司法 5、现代农业,四、测序技术,CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT,（一）一代测序技术,（二）二代测序技术,Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使
5、用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的。 Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。 在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。,技术特点比较,第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。 第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高
6、了测序速度，并且保持了高准确性，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。,五、基因重组技术,基因重组是指一个基因的DNA序列是由两个或两个以上的亲本DNA组合起来的。 基因重组是遗传的基本现象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重组现象。,转基因植物 （抗虫、抗冻、抗病、高产）转基因动物基因工程药物和疫苗基因治疗,基因重组技术的应用,小结,疾病的诊断 感染性疾病诊断 肿瘤性疾病诊断 遗传性疾病诊断 组织配型和器官移植 基因治疗 基因工程产品 转基因植物 转基因动物 基因工程药物和疫苗 法医学方面,分子生物学技术的临床应用,用途广泛 功能强大,基因工程的危险性,基因的世界很奇妙， 期待你的关注和参与！,
