1、分子生物学 常用技术及其应用,主要内容,基 因 工 程 重组DNA技术-基因工程 核酸分子杂交技术 PCR 技术 基因诊断与基因治疗,第一节 基 因 工 程,基因工程的基本概念 工具酶 载体 重组DNA技术的基本原理 重组DNA技术的基本过程 基因工程在医学中的应用,一、基因工程的基本概念,DNA重组：不同来源的DNA分子可以通过末端共价连接而形成重新组合的DNA分子的过程。 基因工程：将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作。,二、工具酶,限制性核酸内切酶 其它工具酶1、DNA连接酶2、DNA聚合酶3、逆转录酶4、
2、多核苷酸激酶5、碱性磷酸酶6、末端脱氧核苷酸转移酶,三、载体,质粒 噬菌体 粘粒 病毒,四、重组DNA技术的基本原理,五、重组DNA技术的基本过程,目的基因的制备方法：1、基因组DNA文库2、制备cDNA文库3、PCR4、化学合成,目的基因与载体的连接方法：1、粘性末端连接2、同聚物加尾连接3、平末端连接4、人工接头连接,将外源DNA导入宿主细胞方法：1、转化2、感染,目的基因的筛选和鉴定方法：1、遗传学方法2、分子杂交法3、免疫学方法,克隆基因的表达,六、基因工程在医学中的应用,医学基础的研究 疾病的诊断和基因治疗 基因工程药物 转基因动物 人类基因组计划 蛋白质工程,第二节重组DNA技术-
3、基因工程,重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。,一、限制酶,限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原
4、核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。,1、限制酶的命名,根据其来源命名。如：属名 菌株名E co R I种名 编号 EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。,2、限制酶识别序列和切割形成,每种限制酶能识别和切割的通常48个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。如：Hare 5-GGCC-3Bam HI 5-GGATCC-3平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差切割形成 粘性末端（sticky end）交错切。,部分常用限制酶及切点,互补末端连接,产生相同序列的突出末端的不同片段 可有三种方式：,1)用同一种限制
5、酶切割； 2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割； 3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。,3、特点：,根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：1) 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。2) 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。3)Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。,二、基因运载体及其选择,载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。,载体具以下特征： 1)分子量小，便于携带较大的DNA
6、片段，能进入宿主细胞并在其中增殖； 2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点； 3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。 常用的载体有：质粒，噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。,（一）.质粒plasmid,Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。PBR322大肠杆菌 pSC101Plasmid chromosome COIEIplasmid 革兰氏阴性菌 pc194scp12真核生物-酵母质粒,常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖
7、而扩增。外源基因插入到MCS后，-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。,EcoRI,HindIII,Ori复制起点,LacZ,APR,pUC19,（二）.-噬菌体(phage),是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。 改建后的噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：,1、置换载体 溶解途径载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。 2、插入载体 裂解途径
8、DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。,裂解途径,（三）.粘粒(cosmid vector) （3040kb）,是将质粒和噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid 而得名Cosmid。改建后的粘粒含有噬菌体的复制起点和cos 末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装3045kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。,(四) 大片段DNA克隆载体,人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：DMD gene 2300kb） ，克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC
9、，PI，YAC等。,1、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）,优点：能携带大片段DNA，约300kb。在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。 缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A, part B）。每个E coli能接受 300kbDNA片段。,2、噬菌体PI载体和PAC,PI噬菌体与噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110115kb）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细
10、胞后环化，扩增。 1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-PAC。,3、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）,适用于克隆大片段DNA，0.22Mb,YAC 的主要功能成份有三：,1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。,三、DNA重组与分子克隆化,为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中
11、分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，称为DNA克隆，亦称分子克隆。,基本原理与过程：,1、分离纯化目的基因2、目的基因 + vector =重组DNA分子3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。4、筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。,分离纯化目的基因 目的基因 + vector =重组DNA分子,重
12、组 DNA和 分子 克隆,重组DNA和分子克隆的几种方法： （依目的基因的来源）,1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆3、化学合成目的基因进行克隆4、PCR体外扩增目的片段进行克隆,从基因组中分离目的基因在细胞中克隆,筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone）,筛查含有目的基因的细胞克隆,四、目的基因表达,上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。 重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物RNA，蛋白质。 就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）
13、。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。（expression cloning）.,目的基因表达,（一）真核细胞的基因在原核细胞 （细菌）中表达,原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆菌为宿主。真核多肽的表达要求：1）适当的cDNA（完整的编码序列）；2）适当的表达载体，提供特定多肽信息；3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。 产物特征：1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；2）活性受限或无活性。,(二) 真核细胞基因在真核细胞中表达,真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作
14、为宿主。 应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达。 产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白的稳定和功能活性。,五 、基因文库基因文库（gene library）,应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的DNA克隆。,（一） 构建基因组DNA文库,（二）染色体特异的基因文库 （ chromosome specific library）,单个染色体 细胞克隆 （流式C仪） 细胞 染色体 染色体文库染色体区带 区带特异 （显微切割 ） DNA文库,（三）cDNA文库（cDNA library）,cDNA文库构建： 特定组织细胞一定发育阶段 总 mRNA,核酸分子杂交技术,第三节,一
15、、分子杂交的原理 DNA双链分子加热变性解链后，如控制好条件，缓慢降温，两条链之间可以根据碱基互补的方式再重新形成双链。（复性） 如把不同的DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，就可在不同的分子间形成杂化双链，这就叫核酸分子杂交。,用途,研究DNA分子中某一种基因的位置，两种核酸分子间的相似性即同源性;也可用于检测某些专一序列在待检样品中的存在与否等。,二、分子杂交的基本方法,Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 斑点及狭缝印迹杂交 原位杂交,三、探针技术,1、探针（probe)：一小段已知序列的
16、用同位素、生物素或荧光染料标记它的末端或全链的多聚核苷酸链。 2、探针技术：将探针与固定在NC膜 上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如果与NC膜上的核酸序列相互补，就可以结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可以叛断膜 上是否有同源的核酸分子存在。,第四节 PCR 技术,何谓PCR？是体外有引物介导的特定DNA序列的酶扩增反应。,一、PCR的基本原理,根据碱基配对原理利用DNA聚合酶和dNTP的参与下，引物依赖于DNA模板特性引导了DNA合成。,二、PCR的基本反应,以DNA为模板的反应 以mRNA为模板的反应 PCR产物的积累规律,三、PCR的主要用途,（一）目的基因的克
17、隆1 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知的目的基因片段；2 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段；3 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆基因。,（二）基因的体外突变（三）DNA的微量分析,第五节 DNA芯片技术,DNA芯片技术的概念和主要类型DNA芯片技术的基本原理和方法DNA芯片技术的应用,第五节 基因诊断与基因治疗,一、 基因诊断,（一）基因诊断的常用技术方法1、核酸分子杂交 2、聚合酶链反应(PCR) 3、单链构象多态性检测 4、限制性内切酶酶谱分析 5、DNA序列测定 6、DNA芯片技术,（二）、基因诊断的应用,1、遗传性疾病 2、遗传易感性疾病 3、感染性疾病 4、肿瘤 5、法医鉴定和组织配型,二、 基因治疗,基因治疗的概念 基因治疗的基本程序基因治疗研究的主要内容或策略基因治疗的应用与展望,
