1、浓汁和粪便标本中病原菌的检测年级专业： 学号： 姓名： 组别： 一、 实验目的：通过革兰氏染色并在油镜下观察细菌形态结构、细菌的生化反应和细菌的血清学反应等手段区别和鉴定脓汁标本中和粪便标本中细菌，检测病原微生物，并进行细菌药物敏感性试验。二、 实验器材：1. 器材：接种环 接种针 打火机 马克笔 酒精灯 电热恒温培养箱 物显微镜 电炉 试管（带棉塞） 称量纸 药勺 牛皮纸 橡皮筋 尺子 锥形瓶 高压蒸汽灭菌器 镊子 玻片 吸水纸2. 实验试剂：普通营养琼脂培养基 蒸馏水 脓汁标本 粪便标本 石蜡油 生理盐水 结晶紫 卢戈碘液 95%乙醇 稀释复红 葡萄糖微量发酵管（ 2 支） 乳糖微量发酵管
2、（2 支） 青霉素抗菌素纸片 链霉素抗菌素纸片 庆大霉素抗菌素纸片 兔血浆 福氏志贺菌诊断血清三、 方法与步骤：1. 培养基的制备：称取一定量的肉汤培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸一次，趁热分装；称取一定量的营养琼脂培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸三次（煮至刚刚冒泡，立刻臵于台面，半分钟后再煮） ，使完全溶解，趁热分装。 （平板培养基：以无菌操作，倾注平皿 10ml，琼脂完全凝固后，平板倒放，4冰箱保存备用。斜面培养基：培养基趁热斜放，培基不超过试管长度的 2/3，琼脂凝固以后，4冰箱保存备用。 ）贴上标签后灭菌使用。2. 细菌分离培养：接种前，接种环烧灼灭菌。取标
3、本在平板表面上方密集涂布 510 mm。烧掉接种环上多余的标本。冷却后，应用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2 份） ，粪便标本接种于伊红美蓝平板（2 份） 。接种完毕后，接种环烧灼灭菌。将平板倒臵 37培养 1824h,观察结果。3. 细菌的群体生长特性观察和纯化培养： 察细菌分离培养物中菌落特征，并记录。 选取平板上相同的菌落数多的，典型的，容易挑取的单菌落。通过无菌操作轻刮取菌，接种于斜面培养基中。接种完毕，灼烧接种环，斜面培养基臵于 37培养过夜。4. 细菌的个体形态特征的观察： 面培养物的观察 革兰氏染色：取洁净载玻片，用灭菌操作后的接种环取生理盐水 1-2 环于玻片上
4、，挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀。待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回 2-3 回合，使标本固定，进行染色。结晶紫染液初染 1 分钟后水洗，芦戈氏碘液媒染一分钟后水洗，95%酒精脱色 20-30s，水洗，稀释复红复染一分钟后水洗。待标本晾干后滴加香柏油，油镜下观察。 通过无菌操作，分别在斜面培养物中挑取菌苔少许，立即移入肉汤培养基管中，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤调和，使菌液混合语培养基中，混匀。接种完毕，试管口通过火焰 2-3 次灭菌，塞好棉塞。接种环灼烧后放下。5. 细菌的糖发酵实验：通过无菌操作，用灭菌接种针刮取新鲜细菌培养物少许，分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微
5、量管内。将微量管平放在平皿内，37培养过夜后观察结果。6. 血浆凝固酶实验：取干净玻片一张，在左右两边分别滴加兔血浆 1-2 滴，生理盐水 1 滴。将接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌冷却后，取细菌新鲜培养物少许，在生理盐水中研磨混匀成细菌悬液。用灭菌接种环取细菌悬液 1 环，或挑取细菌培养物少许，在兔血浆中轻轻抹匀。稍等片刻，观察结果。7. 血清学实验：取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水 15ul。远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清 15ul，用接种环分别取粉红色菌苔，研磨于盐水或血清内，混合均匀。载玻片来回倾侧，让菌液充分混匀，凝集速度更快、结果更清楚。8. 半固体穿刺培
6、养：接种针灭菌处理后挑取菌苔少许，垂直刺入半固体培养基中心，可刺达近底管处，但不要到达管底，然后沿原路退出。接种完毕，试管口迅速通过火焰 2-3 次灭菌，塞好棉塞。接种针灼烧后放下。37培养过夜。9. 细菌药物敏感性试验：接种环取菌液在平板培养基表面，拉出 2 条细菌接种线，使呈“十字形” 。平板密集划线接种细菌。设计三点，呈等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位臵上，按压，镊子火焰灭菌。371824 小时培养，观察结果。四、 结果与讨论：浓汁和粪便标本细菌检测结果标本菌落形态 血浆凝固酶葡 乳 半 福痢血清青 链 庆 结
7、论黄色G+球 + + + + 金黄色葡萄球菌浓汁白色G+球 - + + + 白色葡萄球菌紫黑G-杆 十 十 + - + + 大肠埃希菌粪便粉红G-杆 + - - + - + + 福氏志贺菌结果讨论：1. 在制备好培养基后，我们首先采用的是平板划线分离法，从脓汁标本中分离出黄色和白色两种菌落，在显微镜下观察，这两株细菌均为 G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌，再结合菌落或菌苔颜色，可初步断定，这两株葡萄球菌分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌，再通过血浆凝固酶试验鉴别，金黄色葡萄球菌是致病菌。2. 用伊红美蓝平板，从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌落。显微镜下，它们都是 G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。经糖发酵试验，半固体动力试验，血清学实验结果鉴定，紫黑色菌落是能分解乳糖产酸产气的、有鞭毛的大肠埃希菌，粉红色菌落是不能分解乳糖的、无鞭毛的致病菌。3. 根据药敏试验的结果，金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌对青霉素敏感，而大肠埃希菌和福氏志贺菌对青霉素不敏感。这是由于青霉素针对的是革兰染色阳性细菌，因此对白色菌落和黄色菌落是高度敏感，而链霉素和庆大霉素都是广谱抗生素，对革兰染色阴性和阳性细菌都比较敏感，因此对四种菌落都有较好的抑菌作用。
