1、第15课时 聚合酶链式反应技术,第4章 现代生物技术,学习导航 1.阅读教材P7778内容，掌握PCR技术原理。 2.结合教材P7980内容，了解PCR技术的基本操作过程，讨论PCR技术的影响因素。 重难点击 1.简述PCR的原理。 2.了解PCR技术的基本操作过程并讨论PCR技术的影响因素。,一、PCR的原理,二、DNA片段的PCR扩增和产物检测,内容索引,当堂检测,一、PCR的原理,基础梳理,聚合酶链式反应简称PCR，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的，请结合已学习的DNA分子结构和复制的相关知识，分析PCR的原理。 1.DNA的
2、平面结构示意图,(1)写出各个标号的名称 ； ； ； ； ； ； ； ； ； 。,胞嘧啶,腺嘌呤,鸟嘌呤核糖,胸腺嘧啶,脱氧核糖,磷酸基团,胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸,氢键,碱基对,一条脱氧核糖核苷酸链,(2)DNA的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA链的方向，通常将羟基末端称为3端；将磷酸基团的末端称为5端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。 答案 左链上5端，下3端；右链上3端，下5端。,2.细胞内DNA复制条件分析,脱氧核糖核苷酸,两,DNA双螺旋,合成DNA子链,ATP,3端,3.PCR原理与反应过程 (1)PCR概念：是一种 的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上
3、百万份的DNA拷贝。,体外酶促合成特定DNA片段,(2)条件及作用,合成DNA时所需要的特异引物,原料,耐热TaqDNA聚合酶,缓冲溶液,(3)反应过程 变性,温度上升到 时，目的DNA双链 为单链模板。,复性,温度下降到 左右，两种引物通过 与两条单链DNA结合。,9498,变性解旋,4060,碱基互补配对,延伸,温度上升到 左右，溶液中的 在耐热的_的作用下。根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 循环：继续上述的3个过程，DNA片段被不断的扩增。若开始加入了 N个DNA模板片段，理论上，循环n次后能获得 个DNA片段。,72,四种脱氧核糖核苷酸,TaqDNA,N2n,聚合酶,1.PCR原
4、理 PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。 答案 不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工合成的单链DNA片段。,问题探究,答案,答案,2.PCR反应过程 (1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？ 答案 PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶需耐高温。 (2)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。 答案 每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发
5、挥作用。,(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？,答案 DNA的羟基(OH)末端为3端，磷酸基团的末端为5端。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。,答案,PCR扩增与DNA复制的异同,归纳总结,拓展应用,1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是 A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链 B.DNA复制不需要引物 C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合 D.PCR扩增的对象是氨基酸序列 解析 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要
6、引物； DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，而不能从5端延伸DNA链； 引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合； PCR扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。,答案,解析,2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题： (1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是 。 解析 PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。,答案,解析,DNA的热变性原理,(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶，该
7、酶是从 中分离的。 解析 Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。 (3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是 。 解析 与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。 (4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在 中才能进行，并且要严格控制 条件。 解析 PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。,答案,解析,水生耐热细菌Taq,耐高温,一定的缓冲溶液,温度,(5)PCR中加入的引物有 种，加入引物的作用是 。 解析 PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR
8、扩增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。,答案,解析,2,作为DNA复制的起点,细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？若需要，是如何实现的？ 答案 需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。,答案,与PCR原理有关的三个易错点 (1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。 (2)DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有
9、的单链片段的3端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。 (3)PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。,二、DNA片段的PCR扩增和产物检测,基础梳理,DNA片段的PCR扩增可以利用PCR热循环仪完成，而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行。阅读教材，完善下列内容： 1.DNA片段的PCR扩增：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁,准备,移液,混合,
10、：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，目的是使反应液集中在离心管底部：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应 (1)加入离心管中的物质应包括： 、 酶、4种_、2种 、缓冲液。 (2)离心管中要加入少量石蜡油，目的是 。,离心,反应,模板DNA,TaqDNA聚合,三磷,酸脱氧核苷酸,引物,防止反应溶液的挥发,(3)热循环仪的反应程序应设定为：,94,94,40,72,(4)影响因素：在PCR实验中，需要扩增的DNA片段的大小决定延伸的时间，片段越大，中温延伸的时间 ；引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择，如果引物越短，A、T含量越多，复性温度就 ，反之引物越长，G、C含量越多，复
11、性温度就 ，这是因为G、C之间是由_个氢键连接，A、T之间是由 个氢键连接。 (5)PCR过程中，循环次数是不是越多越好？ 答案 不是。TaqDNA聚合酶在PCR扩增过程中存在1105的出错几率，而且随着循环次数的增加，其活性也会逐渐降低。因此，PCR过程中，循环次数并非越多越好，一般控制在2535个循环。,越长,越低,越高,3,2,2.扩增产物的检测 (1)原理：琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔，带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小，因此大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成DNA条带。 (2)过程 配
12、制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，制作成电泳胶板 在DNA样品中加入0.2倍体积的 混匀,载样缓冲液,取20 L加入 内V稳压电泳2040 min 当 指示剂电泳到凝胶底部时，切断电源 将胶板浸入 溶液染色510 min 在 上观察电泳条带,样品孔,80,溴酚蓝,溴化乙锭,紫外透射仪,问题探究,答案,1.实验过程分析 (1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？ 答案 离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。 (2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？ 答案 离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反
13、应液混合均匀。,(3)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？ 答案 为避免外源DNA等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 2.结果检测 (1)实验中为什么要测定DNA的含量？ 答案 实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。,答案,(2)如何判断DNA扩增成功？ 答案 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。 电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 (3)PCR扩增过程可能会出现哪些异
14、常结果？ 答案 样品产物少，或产生新的DNA。,答案,归纳总结,PCR扩增DNA片段的操作要点 (1)避免外源DNA的干扰，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等都需要在使用前高压灭菌。 (2)缓冲液、酶、DNA引物和DNA模板等如果长期保存，需要在20 冰箱内保存。其中，DNA引物和DNA模板要避免反复冻融，否则容易造成DNA的降解。 (3)在用微量移液管混合PCR反应体系的各种成分时，一定注意避免各种溶液之间的相互污染，需遵循每吸取一种溶液就要更换一个枪头的原则。,(4)为防止DNA引物与模板DNA在室温非特异性结合进行PCR反应，需在冰盒上混合PCR扩增体系的各种组分。 (5)为避免反应过程中高温使
15、EP管中的水蒸气溢出管外而导致PCR过程中各种成分的浓度发生变化，须在PCR反应过程中加入无菌的石蜡油防止溶液的挥发。,拓展应用,3.使用PCR仪具体实验操作顺序应为 设计好PCR仪的循环程序 按配方准备好各组分用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 进行PCR反应 离心使反应液集中在离心管底部 A. B. C. D. 解析 PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)移液混合离心反应。PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。,答案,解析,4.近20年来，PCR技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA
16、半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。,(1)加热使DNA双链间的 键完全打开，称为 ；而在细胞中是在 酶的作用下进行的。 (2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入 种特定的引物。当温度降低至40 时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的 端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是 。 (3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的 和 ，前者由 自动调控，后者则靠 来维持。 (4)通
17、过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是 。,答案,解析,问题导析,氢,解旋,解旋,两,3,从子链的5端向3端延伸,温度,酸碱度,PCR仪,缓冲液,1/8,问题导析 (1)解旋是使DNA双链间的氢键断裂，PCR技术是利用DNA的 原理，细胞内是在 酶的作用下解旋。 (2)DNA分子不论复制几次，含有15N标记的DNA分子都只有 个。,返回上页,答案,热变性,解旋,2,解析 (1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在
18、解旋酶的作用下使氢键断裂。 (2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(9498 )、复性(4060 )、延伸(72 )，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。 (3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲溶液)，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。 (4)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记
19、的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。,返回上页,课堂小结,引物,复性,延伸,PCR仪,琼脂糖凝胶电泳,当堂检测,1.用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸，是一小段 A.DNA B.RNA C.单链DNA或RNA D.双链DNA,2,3,4,5,1,答案,2.符合PCR反应条件的一项是 稳定的缓冲液环境 DNA模板 合成引物 四种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 DNA解旋酶 限制性内切酶 温控设备 A. B. C. D. 解析 PCR反应模拟的是生物细胞内DNA复制的条件，只是无需解旋酶(可热变性)，也不需要基因工程的工具酶(限制性内切酶)。,答案,解析,2,3,4,5,1,3.下列
20、关于PCR的描述中，正确的是 PCR是一种酶促反应 引物决定了扩增的特异性 扩增DNA利用了热变性的原理 扩增的对象是氨基酸序列 A. B. C. D. 解析 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的DNA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3端连接脱氧核苷酸。,答案,解析,2,3,4,5,1,4.下图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物,答案,2,3,4,5,1,解析,A.第一次循环 B.第二次循环 C.第三次循环 D.第四次循环,2,3,4,5,1,解析 在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入
21、的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物和引物与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。,5.聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列问题： (1)DNA的两条链是反向平行的，通常将 的末端称为5端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的 开始延伸DNA链。 解析 一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游离的磷酸基团，含羟基的一端是3端，含磷酸基团的是5
22、端。引物的5端与模板链的3端结合，然后沿着引物的3端延伸。耐高温的Taq DNA聚合酶的发现是实现PCR的关键，该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。PCR一次循环要经历变性、复性和延伸三个阶段。,2,3,4,5,1,磷酸基团,3端,答案,解析,(2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到 ，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫 。 (3)PCR的每次循环可以分为 三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有_个这样的DNA片段。 (4)简述PCR技术的主要应用：_(要求至少答两项)。,2,3,4,5,1,答案,耐高温的Taq DNA聚合酶,选择培养基,变性、复性和延伸,32,遗传疾病的临床诊断、法医鉴定、古生物学、,基因克隆和DNA序列测定等,
