1、感染性疾病的实验诊断,浙江大学医学院附属第一医院 传染病诊治国家重点实验室 杨 青,不适当初始抗菌治疗将导致病死率显著提高,A post-antibiotic era is instead a very real possibility for the 21st century-WHO,提高抗感染水平的关键 -正确的诊断,感染的诊断感染类型，感染部位 病原体的诊断获得确切的病原体 耐药性的诊断耐药菌的种类耐药机制明确,感染性疾病的实验室诊断,体外药敏试验,病例1,患者男性，33岁，有18年乙肝病史 6.27患者无明显诱因地出现头痛伴发热，体温最高达38.7度，伴全身肌肉酸痛，乏力，胃纳差，恶心
2、 6.30在杭州某医院就诊，血常规：白细胞 7.410E9/L，淋巴细胞3.610E9/L，超敏CRP 10mg/l，拟诊为“脑炎”，建议患者住院行腰穿，患者拒绝 7.1来我院就诊，头颅CT未见异常,血培养结果成为诊断的关键,7.1血培养：马耳他布鲁菌,采血指徵,发热（38C）或低温（36C）、寒战、呼吸快 白细胞增多（计数大于10，000109/L，特别有“核左移” 未成熟的或杆状核）、CRP升高 皮肤粘膜出血 血压降低、昏迷、多器官衰竭 血液病：粒细胞减少（成熟的多核白细胞1000109/L）、血小板减少,血培养遇到的问题,血培养阳性率偏低 血培养污染 报告时间较长 (48 72 h),提
3、高血培养阳性率，关键在临床； 改善血培养报告质量，关键在实验室,影响血培养阳性的关键因素,采血时机 采血次数 接种血液数量 皮肤消毒 ,为什么要采双瓶双侧,我院数据,每瓶要保证足够的血量,J Microbiol Immunol Infect, 2013, 46(1): 48-52,浙大一院血培养送检情况,病例2,美平,美平 + 替考,美平 + 替考 + 米卡芬净,特治星 + 万古 + 米卡芬净,泰能 + 替加+万古 + 米卡芬净,7.30血培养阴性 7.31血培养阴性 8.1血培养阴性 8.4血培养阴性,8.6送检血培养,4.5H报警阳性(下午6点） 8.7早上血培养报警阳性，涂片阴性杆菌,立
4、即抽取血培养液离心取菌液上机鉴定药敏 下午3点鉴定结果大肠埃希菌 下午4点药敏结果IMP MIC16ug/ml,TGC MIC 0.38ug/ml，其余抗菌药物均耐药。,PCR证实产NDM-1,初步染色，转种,培养,染色报告,鉴定/药敏试验,血标本 阳性报警,完整报告,血培养三级报告缩短TAT,鉴定,第一天,第二天,第三天,标本质量评估痰涂片,痰标本的采集方法,自然咳痰,呼吸道分泌物培养前一定要做涂片！鳞状上皮细胞、细菌 合格标准只有一个：鳞状上皮细胞10,病例2,患者胡某某，女，52，因“发热半月余，胸痛1周”入院（2013.11.11） 简要病史：患者半月前出现发热，最高体温40.0，1周
5、前感胸痛，深呼吸及咳嗽时较明显，2天前至当地医院就诊，予抗感染治疗，未见明显好转。 既往史有溶血性贫血、高血压病史，长期不规则服用激素,2013.11.11肺CT：两肺多发结节灶,2013.11.14肺增强CT：两肺多发结节伴厚壁空洞，两侧少量胸腔积液，曲霉菌感染首先考虑，恶性病变待排，必要时穿刺活检,痰涂片 （2013.11.13）,涂片报告提示奴卡菌,11.20,2014.1 .1,2.5,3.5,尿培养流程,护理人员 执行医嘱,患者留取标本,实验室,按规程操作 发出报告,临床评价,医生医嘱,大量假阳性,少量假阴性,与临床符合率太低,阴性菌105CFU/ml，阳性菌104CFU/ml,脓液
6、或创面分泌物,标本应区分浅表、深部或手术切口 皮肤消毒非常关键 开放性损伤，无菌生理盐水擦洗病灶表面 未溃破的脓肿宜用碘酒、酒精消毒皮肤 取材部位最好为损伤基底部或病变有进展的边缘，不可仅为脓液 涂片评价标本的质量，快速报告,清洁后金葡菌为主,清洁前取样数种凝固酶阴性葡萄球菌,病例3,革兰染色：可见有折光性菌体,抗酸染色（4+）,血清学诊断方法优点,快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检测标志物，结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效评估,乳胶凝集试验： 以乳胶颗粒作为载体的一种间接凝集试验。即吸附新型隐球菌荚膜多糖抗原于其表面，特异性抗体与之结合
7、后，产生凝集反应胶体金法：,新型隐球菌荚膜多糖抗原检测,阴性,阳性,隐球菌脑膜炎中的应用,李娟等报道墨汁染色涂片诊断隐球菌脑膜炎灵敏度61.1（11/18),脑脊液真菌培养灵敏度38.9(7/18),隐球菌抗原检测灵敏度100(18/18)，特异度99.4%(149/150) 刘正印等报道墨汁涂片染色阳性23例(23/26,88%)，乳胶凝集试验抗原阳性20例(20/20，100%)，培养阳性8例(8/13,62%) 大多数研究报道灵敏度93100%，特异性 9398%,李娟,吕晓菊,等.四川大学学报（医学版）, 2010, 41(6): 1074-1075, 1079 刘正印,王爱霞,等.
8、中华内科杂志, 2002, 41(8): 541-543,肺部隐球菌病中 的应用,GM试验,检测底物：曲霉细胞壁成分半乳甘露聚糖(菌丝在组织生长过程中释放)标本：血清、肺泡灌洗液 方法：ELISA双抗体夹心法cut-off值：ODI 0.5两次ODI 0.5或一次ODI 0.7提高阳性预测值,GM试验的临床价值,血清GM推荐用于恶性血液肿瘤患者和造血干细胞移植患者（未进行抗真菌治疗）早期诊断 非粒缺、实体器官移植（SOT）、ICU患者、已开始抗真菌治疗，建议同时测定BALF GM 半乳甘露聚糖水平的动态变化反应抗真菌药物疗效，指导抗真菌药物使用,47,假阳性,哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林、阿莫
9、西林/克拉维酸 与真菌成分有交叉反应 （组织胞浆菌、皮炎芽生菌、青霉、镰刀霉、头状地霉等） 谷类食物中的GM抗原经肠道入血，化疗并且出现严重黏膜炎的患者更容易发生这种吸收,G试验,检测底物： (1-3)-D-葡聚糖(真菌细胞壁成分50%)标本：血清（无热源采血管），3h内送检 方法：比浊法或比色法cut-off值：不同试剂盒不同G试验可检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉、镰刀霉、支顶孢霉、卡氏肺孢子菌，不能检测隐球菌、接合菌,G试验的临床价值,目前主要用于侵袭性念珠菌和曲霉感染的诊断、高危人群的监测以及对疗效、预后的评价 对于区分确诊或拟诊侵袭性真菌感染与非侵袭性真菌感染患者，有良好的准确性 连续检测
10、可动态反应真菌感染程度和抗真菌治疗疗效,50,假阳性,污染（试管、枪头、蒸馏水） 血液透析、腹膜透析（纤维素膜透析） 外科手术使用纱布 抗肿瘤多糖 静脉制剂（白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子）,51,动态监测,临床应用,WBC 白细胞计数 Endotoxin 内毒素 IL-6 白介素-6 IL-10 白介素-10 TNF 肿瘤坏死因子 Procalcitonin 降钙素原 CRP C反应蛋白 Protein C HMG-1 sTREM-1 ,选择合适血清学指标，帮助临床判断感染的类型、严重程度及疗效,依据生理生化特征进行鉴定的传统方法面临很多的困难,费时，对于分枝杆菌、厌氧菌等需要更长时间 广谱抗
11、菌药物的使用极大降低了培养的阳性率 苛养和少见细菌感染增加 常规的自动化鉴定仪鉴定菌种范围有限，有时无法准确鉴定到种,分子生物学技术在临床的应用,基于基因扩增及测序技术的快速鉴定 蛋白质谱对可培养病原菌的快速鉴定,16S rRNA序列测定 已成为疑难病原菌检测和鉴定的常用方法,Xpert MTB/RIF,Xpert MTB/RIF核酸检测采用Cepheid公司GeneXpert检测系统，是一种半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术，针对rpoB基因81bp利福平耐药核心区间（RRDR）设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者是否结核以及是否对利福平耐药（rpoB序列存在突变）。可同时
12、检测患者是否结核以及是否对利福平耐药 对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单,HIV患者 Tspot 结果阴性,GeneXpert检测系统,分枝杆菌菌种鉴定及耐药性检测（芯片法）,病例4,患者男性，72岁，3月前无明显诱因出现咳嗽咳痰，检查“痰找抗酸杆菌+”，“ CT两中肺结核 右下肺、左下肺炎”，当地医院诊断“肺结核”，给予“异烟肼 乙胺丁醇 利福平”抗结核治疗20天后，出现药物性肝损，护肝降酶治疗效果不佳，TBIL进行性升高，2011.4.14 “TBIL275.4umol/l”,5.16痰找抗酸杆菌,抗酸杆菌？,结核杆菌？,非结核分支杆菌？,
13、奴卡菌？,痰培养： 16sRNA PCR 证实为鼻疽奴卡菌,痰结核菌培养,基因芯片杂交结核分支杆菌阴性鸟分支杆菌阳性,鸟分支杆菌的治疗,对异烟肼（INH）及吡嗪酰胺（PZA）耐药 每周三次给药：克拉霉素或阿奇霉素，利福平、 乙胺丁醇，加或不加阿米卡星，治疗6个月,Agns Ferroni et al, JCM, 2010 A. Bizzini et al, JCM, 2010,基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法MALDI-TOF MS,原理： 用特异性的多肽、蛋白质谱进行菌种鉴定,优势： 快速：20min之内即可得到结果，是现有方法中最快的阳性血培养鉴定法、纯菌株大约10分钟 高特异性和敏感
14、性：接近100% 对部分混合感染样本的准确鉴定,不足： 多报道用于鉴定细菌，酵母菌及分枝杆菌 需要建立严格的标准数据库体系进行比对分析,应用范围： 纯培养菌株、或报警阳性的血培养瓶检测,病例5,男性，50岁，因“咳嗽咳痰伴左颊部溃疡3月”入院 病例特点：3月前患者无明显诱因下出现阵发性咳嗽咳痰，继而出现恶心呕吐，伴有乏力 当地CT：两肺多发感染，两肺多发性弥漫粟粒及小结节影，纵膈、肺门淋巴结多发钙化。 当地血培养提示杰氏棒状杆菌，痰培养提示洛非不动杆菌。 左下肺穿刺病理提示化脓性肉芽肿性炎（PAS+，六胺银+，形态首先考虑真菌感染）,两肺多发团块、结节、粟粒样病灶，以炎性病变（真菌感染）伴左侧胸腔积液首先考虑,血培养,痰培养,常规方法鉴定为杰克棒状杆菌或洛非不动杆菌 质谱仪鉴定为马红球菌,谢谢聆听，请批评 指正！,
