1、基因病的分子诊断 Molecular diagnosis for genic diseases,基因病概念,1975年，Dulbecco 提出：人类的DNA序列是人类的真谛，包括癌症在内的人类疾病的发生都与基因直接或间接有关 1978年，Susumu Tinegawa：从人类所有的疾病都与基因受损有关的角度出发，提出了人类疾病新概念基因病（genic disease）,基 因 病,单 基 因 病（monogenic diseases）,多 基 因 病（polygentic diseases）,获 得 性 基 因 病（acquired genetic disease）,孟德尔遗传性疾病，诸如：白
2、化病、早老症、血红蛋白病、甲型血友病、囊性纤维化病、脆性X综合征等,感染性疾病，诸如：HBV、HCV、HIV、HPV等,复杂性（多因素）疾病，诸如：肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等等,中国：引起死亡的主要疾病,89.1%,91.6%,基因病的分子诊断,诊断分子（标志物） 核酸 蛋白质 多糖类 代谢物（生物小分子） 激素 代谢产物,诊断技术 分子杂交 PCR 测序 芯片 光谱 色谱 质谱 核磁共振 传感器,基因病的分子诊断技术,基于核酸的分子诊断技术 bDNA PCR PCR类型：巢式PCR，等温PCR， 定性PCR PCR产物 RE酶切 电泳 PCR产物 RE酶切 杂
3、交 定量PCR FQ-PCR（real-time PCR） 印迹：Southern/Northern blot Chip：micro-array 测序技术（sequencing）,支链DNA技术（branched DNA, bDNA）,bDNA技术为一种核酸探针杂交标记信号放大技术 特点： 不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素少，因此稳定性、重复性高，结果准确。 操作简便：只需将待测病毒裂解释放出核酸，并将其变性为单链，即可进行检测，不需事先纯化 缺点： 就是放大倍数少、敏感性低、检测范围窄，不适用于低水平检测。 第一代bDNA技术的检测范围3.51055.7107copies/
4、ml 第二代bDNA技术的敏感性有所提高，可2105copies/ml,基因病的分子诊断技术,基于蛋白质的分子诊断技术 ELISA（酶联免疫吸附分析） Chip Western blot 2D 电泳 质谱 飞行时间质谱（TOF） LC-Mass，GC-Mass 核磁共振（NMR）,质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比,HPLC,UPLC,分离,基因病的分子诊断技术,基于代谢组学的分子诊断技术 质谱 核磁共振 光谱 色谱,第十章 感染性疾病的分子诊断 Molecular diagnosis for infectious diseases,感染的慨念,感染是病原体和人体之间的相互作用过程病原体：
5、衣原体、螺旋体、病毒、细菌、真菌、原虫、寄生虫病原微生物：致病菌（条件致病菌）,微 生 物,人体,微 生 物,人体,不 同 的 感 染 状 态,共 生 状 态,在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生,感染后果（转归）,病原体被清除 - 通过非特异性或特异性免疫 隐性感染 - 是感染过程中最常见的类型 显性感染（临床感染） - 感染致病，慢性感染引起炎症 潜伏性感染 潜伏感染期间，病原体一般不排出体外 病原携带状态 - 可以没有临床症状，而能排出病原体 带病原体的种类不同：带病毒者、带菌者与带虫者 不同携带状态 潜伏期携带者、健康携带者、急性与慢性携带者 是很多传染病的重要传染源,感染
6、性疾病的分子诊断策略,一般性策略（检出病原体）： 判断有无感染 是何种病原体感染 常用方法：PCR 杂交 完整性策略： 检出病原体 分型（分类）亚型耐药性 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序,感染性疾病分子诊断标志物,病原体核酸分子（DNA/RNA） 基因表达产物 代谢物 免疫应答分子,定性或定量检测病原体的核酸，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染的诊断 动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和病情预后评价提供客观的依据,感染性疾病的分子诊断临床价值,第一节 病毒的基因检测,病毒,核衣壳（nucleocapsid）,包膜（envelope） 刺突（spike）,核酸（nucleic a
7、cid）DNA or RNA,衣壳（capsid）衣壳粒,核酸,蛋白质衣壳,第一节 病毒的基因检测,检测病毒的方法,血清学检测 病毒分离鉴定（诊断的金标准） PCR技术（检出率最高）,第一节 病毒的基因检测,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）,全世界有3.5亿慢性携带者，75%在亚太地区 每年有一百万人死于HBV感染，是全球范围内第9位死因 中国：50%70%的人受过感染，8%10%是HBV携带者,世界其它地区,亚太地区75%,75%的长期慢性携带者来自亚太地区,第一节 病毒的基因检测,第一节 病毒的基因检测,HBV的形态特征,DNA 病毒双链（非环状）DNA不等长正
8、链（2/3）负链,HBV外膜携带的HBsAg抗原性有一个属特异性的抗原决定簇“a”和至少两个亚型决定簇“d/y”和“w/r”（尚有少见的q、g、n、x和t等亚型决定簇）最常见的血清型为adw、adr和ayw亚型的地区分布不同，我国以adr为主，adw次之，而ayw见于新疆、西藏和内蒙古等地,HBV在肝细胞内的复制,A(n),mRNA,cccDNA,HBsAg包膜,负链DNA,包裹后的前基因 mRNA,传染性HBV 病毒颗粒,传染性HBV 病毒颗粒,部分双链 DNA,逆转录酶,DNA 聚合酶,肝 细 胞,第一节 病毒的基因检测,HBV基因组结构,pre-S1 pre-S1蛋白pre-S2 pre
9、-S2蛋白S HBsAgpre-C HBeAgC HBcAgP DNAPX HBxAg,编码,HBsAg,pre-S2,pre-S1,S区,C区,P区,X区,第一节 病毒的基因检测,基因重叠,急性感染时期HBV的标志物,第一节 病毒的基因检测,HBV 检测窗口期 血清学（HBsAg）：56天 PCR：33天 缩短23天（平均6-15天）,HBV 基因分型,HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型： A型主要存在于白人， B型和C型主要存在于亚洲人群 E型主要存在于西非 F型仅见于中南美洲的土著人 G型和H型很少见 不同基因
10、型序列长度不同，主要是前S1区的不同。我国流行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有较高比例的D型,第一节 病毒的基因检测,第一节 病毒的基因检测,HBV分子诊断方法,HBV DNA检测（PCR） PCR 引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和敏感度。PCR引物常根据其S、C、P和X基因中的高度保守序列来设计。,部分常用的引物序列,1样本处理（样本处理区） 2核酸扩增 2. 1 试剂配置（PCR前准备区） 2. 2 加样（样本处理区） 2. 3 PCR扩增（检测区）,HBV DNA FQ-PCR（real time
11、 PCR）,第一节 病毒的基因检测,HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）,1样本处理（样本处理区） 样本100ul（待测血清或血浆，试剂盒中对照品） 0.5ml离心管中加入100ul DNA提取液1，振荡混匀13,000rpm离心10min；吸弃上清离心时注意固定离心管方向、尽可能吸弃上清且不碰沉淀 再加入25ul DNA提取液2，振荡10sec 沉淀需打散、混匀 2,000rpm离心10 sec，100干浴或沸水浴10min 13,000rpm离心10min，保留上清备用. （如果样本裂解产物当天不使用，则要保存在-20）,第一节 病毒的基因检测,HBV DNA FQ-
12、PCR（real time PCR）,2核酸扩增 2.1试剂配置（PCR前准备区） 从试剂盒中提取出HBV PCR反应液、Tap酶及UNG，室温融化后，2000rpm离心10sec 设所需的管数为n（n=样本数+2管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照+4管阳性参控品） 每个测试反应体系配制如下表： 计算好各试剂的用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个Roche毛细管中分别加入18ul，转移至样本处理区,第一节 病毒的基因检测,HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）,2. 2 加样（样本处理区） 若样本（及对照品裂解产物）保存在-20，使用前置室温解冻
13、，以13,000rpm离心5min 在所设定的n个Roche毛细管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、强阳性对照和临界阳性对照上清液以及阳性参控品各2ul（其中阴性对照做2管），盖紧管盖，连同Roche专用金属反应管套放在离心机中 于2,000rpm离心5sec 将毛细管排好放入Roche PCR仪内，记录样本摆放顺序,第一节 病毒的基因检测,HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）,2. 3 PCR扩增（检测区） 2. 3. 1 循环条件设置2. 3. 2 仪器检测通道选择选择F1通道,第一节 病毒的基因检测,HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
14、,结果分析条件设定 选F1或F1/F2通道，点击Quantification进入定量分析窗口； 在Quantification窗口中，设定Analysis方式为Fit points Adjustment方式为Arithmetic；选定Noise band项，阈值（Noise band cursor）设定以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值不出现任何数值为准，也可根据仪器的实际情况进行调整,第一节 病毒的基因检测,HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）,检测质控标准： 四个阳性参控品的Ct值都应小于38.0，将阳性参控品1-4的拷贝浓度输入，仪
15、器将自动以阳性参控品拷贝浓度的对数值为横坐标，以其实际测得的Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的拟和度应小于等于-0.980，否则视为定量结果无效 两个阴性对照的Ct值应无数值，HBV DNA拷贝数应为0 copies/ml；强阳性对照的Ct值应小于等于30.0，HBV DNA拷贝数应为1105-1107copies/ml 临界阳性对照的HBV DNA拷贝数应为1103-9104 copies/ml，Ct值大于强阳性对照的Ct值，并小于等于38.0，否则实验视为无效,第一节 病毒的基因检测,HBV DNA FQ-PCR（real-time PCR）,结果判断： FQ-PCR进行HBV DNA
16、的定量检测，检测范围为2.51022.5109 copies/ml 检测样本中5102 copies/mlHBV DNA5107 copies/ml，测定结果有效，可直接报告相应的拷贝数 检测样本中HBV DNA5107 copies/ml，既可直接报告为5*107copies/ml，也可用正常人血清按10倍剃度做相应稀释，使其拷贝数落在1105-5107 copies/ml范围内，再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正 检测样本HBV DNA510 copies/ml时，拷贝数仅供参考，报告为小于最低检出限 Ct值无数值时, 报告为0.0 copies/ml,第一节 病毒的基因检测,第一节
17、 病毒的基因检测,HBV耐药检测（ YMDD突变检测方法）,YMDD突变检测方法,1. 基因测序法 2. 荧光定量PCR方法 基本原理 确定探针特定的TM值来区分是否突变 常用方法 覆盖突变位点荧光双探针杂交,YIDD YMDD YVDD,46.91 54.64 50.74,第一节 病毒的基因检测,HBV的分子诊断的临床应用,早期诊断 监测治疗效果（病毒拷贝数） 判断病情 耐药检测,第一节 病毒的基因检测,丙型肝炎病毒（HCV）,急性丙肝的临床诊断 1. 流行病学史：有输血史、应用血液制品史或明确的HCV暴露史。 2. 临床表现：全身乏力、食欲减退、恶心和肝区疼痛等，其他可有低热，轻度肝肿大，
18、脾肿大，黄疸。部分患者无明显症状。 3. 实验室检查：ALT多呈轻度和中度升高，抗-HCV和HCV RNA阳性。 约90%的输血后非甲非乙型肝炎和7080%的无输血史的散发型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致,第一节 病毒的基因检测,HCV,血中HCV含量仅为HBV的千分之一 HCV的细胞培养尚未成功，病毒的分离极为困难 HCV的变异性很高，使其诊断十分困难 HCV的免疫学标志仅有抗HCV一项，且由感染至抗体产生大约需要70天，部分病人感染后始终都不形成抗体,第一节 病毒的基因检测,HCV分子诊断技术尤为重要,HCV基因组（单链RNA）,呈球形颗粒 直径约50nm 有一脂质包膜 核心：单股正链RN
19、A，全长9.4 kb 仅一个开放读框（ORF），编码一条含有3008 3037个氨基酸的病毒前体多肽,第一节 病毒的基因检测,HCV基因分型的多样性,由于HCV的RNA聚合酶的忠实性不高，所以引起HCV的基因型呈多样性 HCV分为6个（IVI）主要基因型（Simmonds），各型又由若干亚型（a、b、c）组成 HCV RNA基因分型有助于判定治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的个体化方案,第一节 病毒的基因检测,HCV分子诊断,HCV RNA定性 定性检测方法：RT-PCRHCV RNA定性检测的特异度在98%以上，只要一次病毒定性检测为阳性即可确证HCV感染 一次检测阴性不能完全排除HCV感染，
20、应重复检查,第一节 病毒的基因检测,HCV分子诊断,HCV RNA定量（病毒载量测定） bDNA real-time RT-PCR（SOP） 1 样本处理（样本处理区） 2 扩增试剂准备（PCR前准备区） 3 加样（样本处理区） 4 RT-PCR反应（检测区）,第一节 病毒的基因检测,HCV RNA定量（real-time RT-PCR）（SOP文件） 1 样本处理（样本处理区） 1.1 阳性对照：先用100ulDEPC水复溶血清冻干粉制成强阳性对照；取10ul强阳性对照制成临界阳性对照； 1.2 标记：取n个0.5ml灭菌离心管（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照）；
21、 1.3 先加150ul裂解液，后分别加50ul样本（待测样本、阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照），再加入50ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec（不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）； 1.4 13,000rpm离心15min（如有条件,于4进行离心）； 1.5 另取n个0.5ml灭菌离心管，加入100ul异丙醇（-20预冷），作好标记；吸取步骤1.4各管中的上层液相互转移至相应的管中，颠倒混匀； 1.6 13,000rpm离心15min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入300ul 75%乙醇，颠倒洗涤； 1.7 13,000rpm离心10min，轻轻倒去上清液，倒
22、置于吸水纸上，尽量沾干液体； 1.8 4,000离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，室温干燥1-5min（不宜过于干燥，以免RNA不溶）； 1.9 加16ul EDPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000rpm离心5sec，冰上保存备用（注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请立即进行后续步骤）,第一节 病毒的基因检测,HCV RNA定量（real-time RT-PCR）（SOP文件） 2扩增试剂准备（PCR前准备区） 从试剂盒中取出HCV RT-PCR反应液、PCR Enhancer，在室温下融化后，2,000rpm离心5sec，设所需Roche
23、专用毛细管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照），每个测试反映体系配置如下表：计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，并向其中加入n/2颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀向每个Roche专用毛细管中各分装9ul，转移至样本处理区,第一节 病毒的基因检测,HCV RNA定量（real-time RT-PCR）（SOP文件） 3加样（样本处理区） 在各设定的Roche 毛细管中分别加入上述样本处理步骤1.9中制备的RNA溶液各16ul，盖紧毛细管管盖，连同Roche专用金属毛细管套放入离心机中，于2,000 rpm离心5sec，将毛细管排好放入Roche PCR荧
24、光检测仪内，记录样本摆放顺序 4RT-PCR反应（检测区） 4.1 循环条件设置4.2 仪器检测通道选择F1通道,第一节 病毒的基因检测,HCV RNA定量（real-time RT-PCR）（SOP文件）,结果分析条件设定 选F1或F1/F2通道，点击Quantification 进入定量分析窗口 在Quantification窗口中 Analysis方式为Fit points Adjustment 方式为Arithmetic 选定Noise band项，与阈值（Noise band cursor）设定以超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，以Ct值不出现任何数值为准，也可根
25、据仪器的实际情况进行调整,第一节 病毒的基因检测,HCV RNA定量（real-time RT-PCR）（SOP文件）,质控标准 阴性对照的检测结果为阴性 强阳性对照的Ct值应小于等于30.0 临界阳性对照的Ct值应大于强阳性对照的Ct值 否则此次实验视为无效 结果判断 Ct值无数值的样本为阴性样本 Ct值36.0的样本为阳性 Ct值大于36.0的样本建议重做，重做结果无数值者为阴性，否则为阳性,第一节 病毒的基因检测,HCV试剂盒使用注意事项（SOP文件）,本试剂盒仅用于体外检测，使用前请仔细阅读本说明书 实验请严格分区操作： 第一区：PCR前准备区准备扩增所需试剂 第二区：样本处理区待测样
26、本和对照品处理 第三区：检测区PCR扩增检测 各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染，实验后即请清洁工作台 试剂盒内各试剂使用前，充分融化后，稍时离心（目的？） 反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧（以避免荧光物质泄露污染仪器） 实验中用过的吸头请直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸中，并与其他废弃物一同灭菌后丢弃 工作台及各物品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒 由于HCV为RNA病毒，提取过程中应特别注意防止RNase对RNA的降解作用，所使用的器皿、加样器等均为专用，离心管、吸头等在实验前应全部用DEPC水浸泡，并高压灭菌（目的？） RT-PCR酶颗粒
27、极易吸潮失活，必须在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需要的数量,第一节 病毒的基因检测,HCV RNA定量结果表示方法,HCV RNA定量检测法有两种表示方法： 拷贝/ml（罗氏公司Cobas V2.0） IU/ml（美国国立遗传学研究所的SuperQuant） 两者之间可以进行换算，IU/ml与拷贝数/ml换算公式是：IU/ml=0.854拷贝数/ml + 0.538,第一节 病毒的基因检测,特别说明,应注意HCV RNA检测中的假阳性和假阴性 在HCV急性感染期，在血浆或血清中的病毒基因组水平可达到105107拷贝/ml 在慢性感染者中，HCV RNA水平变化范围在51045106
28、拷贝/ml之间，同一患者血液中HCV RNA的水平相对稳定 HCV病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可以作为抗病毒治疗疗效评估的观察指标（“评估”和“预测”）,第一节 病毒的基因检测,DNA病毒 具有宿主和组织特异性：人是HPV惟一自然宿主 传播途径：主要通过接触感染 生殖器主要经性接触传播 新生儿可经产道感染 不同型的HPV侵犯的部位和所致疾病也不同 HPV的免疫防御机制尚不十分清楚 HPV的致癌潜力分为 高危型：主要包括HPV 16、18、31、33、45、35、39、51、52和58等（其中HPV 16和HPV 18与子宫颈癌发生密切相关） 低危型：主要包括HP
29、V6和HPV11,人乳头状瘤病毒（HPV）,第一节 病毒的基因检测,中国妇女人乳头状瘤病毒（HPV）感染和宫颈癌流行病学调查 大规模的人群专项调查发现：我国城乡妇女高危型HPV感染率均较高，并在2024岁和4044岁两个年龄段呈现感染高峰； 以医院为基础、覆盖7个地区的调查显示：我国妇女83%的子宫颈浸润癌、84%的子宫颈鳞癌均有HPV 16型或18型引起； HPV 16型和18型是导致我国妇女患子宫颈癌的最主要原因 http:/www.china-（2008-6-22）,第一节 病毒的基因检测,HPV,HPV基因组,病毒基因组是双链DNA，其中一条是有意义链，含3个基因区 早期区：含7个开放
30、读码框 晚期区：编码2种外壳蛋白（主要外壳蛋白L1，次要外壳蛋白L2） 非编码区（ NCR ）：即上游调控区 位于晚期基因L1终止密码子与早期基因E6第一个起始密码子之间，长度在不同的乳头瘤病毒中不一样，约1.0kb NCR转录的启动子序列，可以启动早期基因的转录和表达 目前HPV尚不能在组织细胞中培养,第一节 病毒的基因检测,NCR,HPV检测,可以对典型的疣状病损根据临床表现做出临床诊断 实验室诊断 分子生物学方法检测HPV DNA 在诊断同时确定型别：如斑点杂交、原位杂交，DNA印迹法（此法为最可靠的方法） 以HPV基因型特异性引物进行PCR扩增，再用特异性探针杂交法检测扩增产物（此法特
31、异、敏感、被广泛采用） 免疫印迹（Western blot）检测病人血清中基因型特异性抗体 以重组表达的HPV蛋白（如：HPV L1和L2）为抗原，测抗体,第一节 病毒的基因检测,HPV DNA PCR检测,HPV基因检测中部分常用的引物,第一节 病毒的基因检测,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2008,for his discovery of HPV causing cervical cancer 哈拉尔德楚尔豪森（德国） 发现了可以引起宫颈癌的HPV,for their discovery of HIV 弗朗索瓦丝巴尔西诺西（法国） 吕克
32、蒙塔尼（法国） 发现了HIV,第一节 病毒的基因检测,human immunodeficiency virus（ HIV ）,第一节 病毒的基因检测,全国累计报告HIV感染者地理分布,截至2005年12月底,第一节 病毒的基因检测,HIV在宿主细胞中的复制,Step 1: Binding Step 2: Reverse Transcription Step 3: Integration Step 4: Replication Step 5: Translation Step 6: Viral Assembly,第一节 病毒的基因检测,靶细胞：CD4+ T 细胞,HIV基因组,基因组为RNA双分
33、子，与其它逆转录病毒基本相同 其正链RNA分子大小为HIV-1 9.3 kb 有3 组共8个基因HIV-2 9.7 kb 有3 组共9个基因 5端有帽子结构，3端有poly(A)结构,第一节 病毒的基因检测,HIV基因组,第一组：逆转录病毒共同的结构基因和侧翼末端重复顺序（long terminal repeats）gag（group of antigen)基因：编码核心蛋白pol （polymerase）基因：编码逆转录酶，DNA聚合酶 env（envelop）基因：编码包膜蛋白 LTRs：不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性 第二组：参与基因表达的调节基因tat（tran
34、s-acting transcriptional gene）rev（regulator of expression of viral protein）nef（negative regulator factor） 第三组：负调控病毒的感染性，成熟或释放的基因vif（viral infectivity factor）vpu（viral protein U）vpr（viral protein R）,第一节 病毒的基因检测,HIV基因组遗传变异率高,高度变异区在env基因内，相当于gp120的五个区段，gag和pol基因较少变异，是基因组的保守区域HIV疫苗研发难度大,第一节 病毒的基因检测,HIV-
35、1感染后病毒标志物的变化,第一节 病毒的基因检测,窗口期： 检测抗体 2-12周 检测p24抗原 2-3周 检测RNA 11天,HIV检测,HIV抗体检测（窗口期测p24抗原，可辅助诊断 ） 初筛试验：酶联免疫吸附试验（ELISA） 试纸（金标试纸，双抗原夹心法） 最短在感染6天之后就可以检测到 确认试验：免疫印迹（Western blot, WB） HIV RNA 测定（RT-PCR）,第一节 病毒的基因检测,HIV病毒载量（HIV RNA 定量）,主要有三种技术： RT-PCR（最低检测限为50copies/ml ） bDNA（最低检测限为50copies/ml） NASBA（最低检测限为
36、20 copies/ml） NASBA（nucleic acid sequence-based amplification） 基于核酸等温扩增技术PCR检测前病毒DNA，对出生48h内婴儿的检测敏感性为38%，出生14d婴儿的检测敏感性可为93%,第一节 病毒的基因检测,SARS冠状病毒（SARS coronavirus）,严重急性呼吸综合症（severe acute respiratory syndrome, SARS） SARS冠状病毒（SARS CoV）是一种新的变种的冠状病毒 引起传染性非典型肺炎，是一种急性呼吸系统感染疾病,第一节 病毒的基因检测,冠状病毒,1937年，从鸡身上分离出
37、来的 电镜下，其形态外膜呈日冕状或者叫做皇冠状突起 1968年，科学家秦瑞将其命名为“冠状病毒” 直径大约60-220纳米,第一节 病毒的基因检测,SARA CoV基因组,基因组为正链单链RNA ，全序列共约29KB 有11个ORF，编码：依赖于RNA的RNA聚合酶（rep）、4种结构蛋白（S,E,M,N）、5种未知蛋白 特点：RNA和RNA之间重组率非常高，重组改变了RNA序列，进一步可导致蛋白质的氨基酸序列改变，出现高变异,spike protein,membrane protein,small membrane protein,nucleocapsid protein,第一节 病毒的基因
38、检测,第一节 病毒的基因检测,SARA CoV 检测,WHO推荐SARS-CoV特异性检测方法： 细胞分离培养 免疫学检测 分子生物学检测 NASBA：反应在42进行，循环4到5次即可扩增106倍，可以在2小时左右将模板RNA扩增约109倍 RT-PCR、FQ-PCR：大约需要20次循环才能扩增106倍 中山大学达安基因诊断中心，根据SARS-CoV基因组序列（NC-004718）设计引物进行FQ-PCR扩增： P1：5-CGGCAAAATGAAAGAGCTCA-3； P2：5-CGCCGTAGGGAAGTGAAGCT-3， 探针序列：5-CCCAGATGGTACTTCTATTACCTA-3
39、特异性扩增片段长85bp,第一节 病毒的基因检测,风疹病毒（rubella virus, RV）,RV是风疹的病原体，人类是RV的唯一宿主 妇女怀孕4个月内，若感染RV，RV可通过胎盘感染胎儿，引起先天性风疹综合症，出现各种先天性畸形，甚至出现死胎、流产或出生后死亡 RV基因组为单链正链RNA，5端有帽子结构、3端有polyA结构（类似于真核细胞mRNA） RV 基因组由9759个核苷酸组成，2个相互不重叠的ORF ORF1编码3个非结构蛋白前体p200 ORF2编码2个结构蛋白前体p90,第一节 病毒的基因检测,风疹病毒（rubella virus, RV）,RV分子诊断 分子杂交 RT-P
40、CR FQ-PCR,第一节 病毒的基因检测,单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）,有两种血清型（HSV-1和HSV-2），两型DNA碱基的同源性为20%70%，因此，型间有抗原性交叉 HSV-1主要感染眼、口、唇的皮肤粘膜，可沿嗅神经或三叉神经到达中枢神经系统，引起脑炎，偶见于外生殖系统。 HSV-2主要与外生殖系统及新生儿感染有关，也可引起多种脏器的病变，偶见口腔病变，HSV-2与宫颈癌关系密切。 HSV病毒体呈球形，直径150200nm，核心有双股线性DNA HSV-1和HSV-2的基因组有34个基因，编码70多个蛋白质。 分子诊断方法 PCR、FQ-PCR、
41、竞争性PCR、免疫杂交PCR等方法检测标本中的HSV DNA,第一节 病毒的基因检测,HSV分子诊断,第一节 病毒的基因检测,巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）,人群中HCMV感染非常普遍，60%90%的成人可检出HCMV抗体 CMV成熟病毒颗粒的形态、结构与其他疱疹病毒相似，直径约150200nm 基因组：双链、线性DNA，全长240 kb 与其他CMV相比，HCMV的编码基因有3个特点 富含糖蛋白编码基因，约有3050个ORF； 编码的氨基酸序列种类繁多，包括酸性、碱性氨基酸成簇状排列、间歇性重复排列等； 有9个同源基因家族，同家族内的ORF编码能力十分相似,第一节 病
42、毒的基因检测,CMV分子诊断,NASBA技术：扩增CMV pp65蛋白mRNA。 操作简便，不需特殊仪器，反应在42进行，由3种酶控制，循环次数少，忠实性高，扩增效率高于PCR，特异性好 PCR大约需要20次循环才能扩增106倍，而NASBA只需循环4到5次即可扩增106倍，可以在2h左右将模板RNA扩增约109倍 PCR,第一节 病毒的基因检测,分子诊断技术在很大程度上改变了感染性疾病的诊断方法,适用于检测不能或不易培养、生长缓慢的病原微生物，如结核分枝杆菌、苍白螺旋体、病毒等； 通过检测细菌16SrRNA基因或对其测序，对细菌进行种属鉴定，并可能发现新菌种； 进行病原体感染的早期诊断，确定
43、感染病原体的类型； 通过对病原体核酸的定量检测动态监测疾病进展； 进行病原体感染的分子流行病学调查； 对病原体进行基因分型； 检测病原体的耐药基因等，为临床诊治、疗效观察提供科学依据，避免了病原体传统检测技术的缺点，避免了血清学检测的不足，如血清学检测的“窗口期”问题，具有快速、特异、灵敏度高等优点。,第一节 病毒的基因检测,病毒感染的潜伏期（窗口期）血清中并无抗体的存在，无法以免疫学的方法来检测PCR检测病毒量的变化上，比传统的方法更快速，有更高的特异性及灵敏度,第一节 病毒的基因检测,分子诊断技术在很大程度上改变了感染性疾病的诊断方法,小结与思考,基因病（单基因病、获得性基因病、复杂性疾病） 分子诊断标志物（生物大分子、生物小分子） 分子诊断技术（PCR、RT-PCR、real-time PCR、FQ-PCR、NASBA、bDNA、WB、ELISA、sequencing、DHPLC、chip、NMR、质谱、色谱） 病毒（HBV、HCV、HIV、HPV、SARS CoV、 HSV、CMV、RV、influenza virus） 窗口期 SOP 感染性疾病与传染性疾病分子诊断策略 如何设计高通量分子诊断方法？ 分子诊断在应对突发性重大公共卫生事件中的作用？,第一节 病毒的基因检测,柯萨奇病毒,第一节 病毒的基因检测,禽流感病毒,第一节 病毒的基因检测,H5N1型,
