1、实验六 蛋白质等电点测定一、实验目的掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理；了解等电点的意义及其与分子聚沉能力的关系。二、实验原理蛋白质同氨基酸一样，是两性电解质，在不同的 pH 水溶液中解离后所带正、负电荷不同。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态出现，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。各种蛋白质具有特定的等电点，这时和它所含的氨基酸的种类和数量有关。如蛋白质分子中含碱性氨基酸较多，其等电点偏碱。例如从雄性鱼类成熟精子中提取的鱼精蛋白含精氨酸特多，其等电点为 12.012.4
2、。如蛋白质分子中含酸性氨基酸较多，则其等电点偏酸。例如胃蛋白酶含酸性氨基酸残基为 37 个，而碱性氨基酸残基仅含 6 个，其等电点为 1.0左右。含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点大多为中性偏酸，约 5.0 左右。蛋白质等电点多接近于 pH7.0，略偏酸性的等电点也较多。处于等电点的蛋白质表现电中性，所以在溶液中的稳定性很低，容易沉淀析出。将酪蛋白溶液分置于连续不同的 pH 环境中，通过观察混浊程度可测得酪蛋白的等电点。三、实验器材1.仪器：试管和试管架、滴管、吸管(1 和 5mL)、容量瓶。2.材料：蛋白质。3.试剂：酪蛋白醋酸钠溶液、0.01mol/L 醋酸溶液、1.00mo
3、l/L 醋酸溶液、0.10mol/L醋酸溶液、1.00mol/L 氢氧化钠溶液。四、实验步骤取 9 支粗细相近的干燥试管，编好号后按表 5-1 的顺序准确地加入各种试剂。加完后观察上述各管的混浊程度，静置约 20min，再视其沉淀情况，以-，+，+，+，+符号表示沉淀的多少；根据观察的结果，指出哪一个 pH 是酪蛋白的等电点(混浊显著或静置后沉淀最多，上部溶液变得最清亮一管的 pH 值，即为酪蛋白的等电点);该试管要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。除了需要精心配制试剂以外，实验中应该严格按照定量分析的操作进行。为了保证实验的重复性或为了进行大批量的测定，可以事先按照上述的比例配制成大量的
4、 9 种不同浓度的醋酸溶液。实验时分别准确吸取 4mL 该溶液，再各加入1mL 酪蛋白醋酸钠溶液。试剂加入及数据记录表观察沉淀出现情况管号酪蛋白醋酸钠溶液（毫升）水（毫升）0.01mol/L醋酸（毫升）0.10mol/L醋酸（毫升）1.00mol/L醋酸（毫升）pH 0分钟10分钟20分钟1 1 8.38 0.62 5.92 1 7.75 1.25 5.63 1 8.75 0.25 5.34 1 8.50 0.50 5.05 1 8.00 1.00 4.76 1 7.00 2.00 4.47 1 5.00 4.00 4.18 1 1.00 8.00 3.89 1 7.40 1.60 3.5五、注意事项1.为了减小误差，添加试剂是用移液管量取试剂，不能使用量筒粗量。2.为了保证实验的重复性或为了进行大批量的测定，可以事先按照上述的比例配制成大量的 9 种不同浓度的醋酸溶液。六、思考题1.该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？2.蛋白质等电点在实际生产上有何意义？
