1、生化试验指导实验一：蛋白质及氨基酸的呈色反应目的：1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。（一） 双缩脲反应实验原理尿素加热至 180左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与 cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 实验器材及试剂器材： 试管、酒精灯、试管夹、试管架试剂： （1）尿素（2）10%氢氧化
2、钠溶液（3）1%硫酸铜溶液（4）2卵清蛋白溶液实验步骤1.取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加 10氢氧化钠溶液约 1 毫升，振荡混匀，再加 1硫酸铜溶液 1 滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 2.向另一试管加卵清蛋白溶液约 l 毫升和 10氢氧化钠溶液约 2 毫升，摇匀，再加 1硫酸铜溶液 2 滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。 （二）茚三酮反应实验原理 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有 氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
3、 该反应十分灵敏，1：1 500 000 浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成 CO2、NH 3 和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。实验器材及试剂器材： 试管、酒精灯、试管夹、试管架试剂： (1)蛋白质溶液：2卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液 (蛋清：水 1：9)(2)0.5甘氨酸溶液 (3)0.1茚三酮水溶液 (4)0.1茚三酮乙醇溶液 实验步骤(1)取 2 支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液 1 毫升，再各加 0.5 毫升 0.1茚三酮水溶液，混匀
4、，在沸水浴中加热 12 分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。 (2)在一小块滤纸上滴一滴 0.5的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴 0.1的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。（三）黄色反应实验原理含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下： 实验器材及试剂器材： 试管、酒精灯、试管夹、试管架试剂： (1)鸡蛋清溶液 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按 1：20 混匀，然后用六层纱布过滤。(2)大豆提取液 将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状用纱布过滤。(3)头发 (4)指甲 (5)0.5苯酚溶液(6)浓硝
5、酸 (7)0.3色氨酸溶液(8)0.3酪氨酸溶液 (9)10氢氧化钠溶液 实验步骤向 7 个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。（四）考马斯亮蓝反应实验原理考马斯亮蓝 G250 具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在，呈棕红色；在偏中性溶液中呈蓝黑色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。在 0.011.0mg 蛋白质范围内，蛋白质浓度与 A595nm 值成正比。常用来测定蛋白质含量。实验器材及试剂器材： 试管、移液管、试管架试剂： （1）考马斯亮蓝染液（2）蛋
6、白质样品思考题1.通过本次试验，你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的原理？2.从本次实验的每个实验中，应该注意的事项都有哪些？实验二 蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、蛋白质等电点的测定实验目的 (1)了解蛋白质的两性解离性质。 (2)学习测定蛋白质等电点的一种方法。实验原理蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的 pH 达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数日相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的 pH 值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化
7、，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液 pH 值。本实验借观察在不同 pH 溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中) 配制成各种不同 pH 值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的 pH 值即为酪蛋白的等电点。实验器材及试剂器材： 水浴锅、温度计、200 毫升锥形瓶、100 毫升容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵 试剂： (1)0.4酪蛋白醋酸钠溶液 (2)1.00 摩尔升醋酸溶液 (3)0.10 摩尔升醋酸溶液 (4)0.01 摩尔升醋酸溶液 实验步骤(1) 取同样规格的试营 4 支，按下表
8、颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。 (2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液 1 毫升，加一管，摇句一管。此时1、2 、3 、4 管的 pH 值依次为 5.9、5.3、4.7 、3.5。观察其混浊度。静置 10 分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的 pH 即为酪蛋白的等电点。 二、蛋白质的沉淀及变性 实验目的 (1)加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 (2)了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 (3)了解蛋白质变性与沉淀的关系实验原理在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颖拉可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应
9、可分为两类。 (1)可逆的沉淀反应； (2)不可逆沉淀反应； 实验器材及试剂试剂：(1)蛋白质溶液 (2)pH4.7 醋酸醋酸钠的缓冲溶液(3)3%硝酸银溶液(4)5三氯乙酸溶液 (5)95乙醇(6)饱和硫酸铵溶液7)硫酸铵结晶粉末(8)0.1mol/L 盐酸溶液(9)0.1mol/L 氢氧化钠溶液(10)0.05 碳酸钠溶液 (11)0.1mol/L 醋酸溶液(12)甲基红溶液实验步骤(1)蛋白质的盐析。 无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等) 浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。 如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。 加 5卵靖蛋白溶液
10、5 毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混蚀沉淀，加少量水，是否溶解，为什么？(2)重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。取一支试管，加入蛋白质溶液2 毫升，再加 3硝酸银溶液 12 滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾出上消液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？(3)某些有机酸沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白质溶液 2 毫升，再加入 1 毫升 5三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。 (4)有机溶剂沉淀蛋白质 取一支试管，加入 2 毫升蛋白质溶液
11、，再加入 2 毫升 95乙醇。混匀，观察沉淀的生成。思考题1.通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法?它们的原理?2.测定 pI 有什么意义？ pI 是固定常数的吗？ 3.解释下列名词：水化层；双电层；蛋白质变性；盐溶与盐析；蛋白质等电点沉淀。 4.根据实验现象，讨论下列问题： 1） 蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么？ 2）简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。实验四 氨基酸的分离鉴定纸层析法实验目的1.通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法2.掌握氨基酸纸上层层析法的操作技术（点样、平衡、展层、显色、鉴定）实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分
12、配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用 Rf 值( 比移 )来表示的：Rf = 原点到层析中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的 Rf 值是常数。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 实验器材及试剂器材： 层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、层析滤纸 试剂： 1.扩展剂 是 4 份水饱和的正丁醇和 1 份醋酸的混合物。将 20mL 正丁醇和 5mL 冰醋酸放人分液漏斗中，与 15mL 水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约 5mL 置于小烧杯中
13、做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。2.氨基酸溶液 0.5的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为 05) 。3.显色剂：50lOOmL0.1水合茚三酮正丁醇溶液。实验步骤1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。2.取层析滤纸(长 22 cm、宽 14 cm)一张。在纸的一端距边缘 23 cm 处用铅笔划一直线，在此直线上每间隔 2cm 作一记号。3.点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这 6 个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过 3mm。4.扩展 将滤纸折成 W 状，纸的两边不能接触。将盛有约 20 mL 扩展剂的培养皿，迅速置于密
14、闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线 1cm)。待溶剂上升 1520 cm 时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。5.显色 用喷雾器均匀喷上 0。1茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤 5分钟(100 )或用热风吹干即可显出各层析斑点。 6.计算各种氨基酸的 Rf 值。思考题1. 何谓纸层析法?2. 2.何谓及 f 值?影响只 f 值的主要因素是什么?3. 3.怎样制备扩展剂?实验五 酪蛋白的制备实验目的 1.学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 2.掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。 实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量
15、约为 35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为 4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的 pH 调至 4.7 时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。 实验器材及试剂器材： 离心机、抽滤装置、精密 pH 试纸或酸度计、电炉、温度计试剂： 1.新鲜牛奶 2.95%乙醇 3.无水乙醚 4.0.2mol/L pH4.7 醋酸 醋酸钠缓冲液 5.乙醇 乙醚混合液：乙醇乙醚=1 1（V/V）实验步骤一）酪蛋白的粗提 100mL 牛奶加热至 40。在搅拌下慢慢加入预热至 40、pH4.7 的醋酸缓冲液100mL，用精密 pH 试纸或酸度计调 pH 至 4.
16、7。 将上述悬浮液冷却至室温。离心 15 分钟（3000 r /min） 。弃去清液，得酪蛋白粗制品。（二）酪蛋白的纯化 1.用水洗涤沉淀 3 次，离心 10 分钟（3 000r/min） ，弃去上清液。 2.在沉淀中加入 30mL 乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇乙醚混合液洗沉淀 2 次。最后用乙醚洗沉淀 2 次，抽干。 3.将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品（三）准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白 g/100 mL 牛乳（g%）式中理论含量为 3.5g/100mL 牛乳。 测得含量/ 理论含量 x100%式中理论含量为 3.5g/100mL 牛乳。 思考题
17、1.制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 2 试设计另一种提取酪蛋白的方法实验六 酶的特性实验目的 1. 加深对酶的性质的认识。 （一）温度对酶活力的影响实验原理酶的催化作用受温度的影响，在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为 3740，植物酶的最适温度为 5060。 酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到 100，其活性并无明显改变，但在 I100的溶液中却很快地完全失去活性。 低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。 实验器材及试剂器材： 试管及试管架、恒温水浴、冰浴、沸水浴 试剂： (1)0.2淀粉的 0.3氮化钠溶液。需新鲜配制。 (2)稀择 50
18、 倍的唾液。用蒸馏水漱口，以清除食物残渣、再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量简并稀碌 50 倍，( 稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整 )混匀备用。 (3)碘比钾碘溶液。将碘化钾 20 克及碘 10 克溶于 100 毫升水中。使用前稀释10 倍。 淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，退碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遏碘不呈颜色，麦芽糖遏碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。实验步骤淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，退碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遏碘不呈颜色，麦芽糖遏碘也不呈色。在不同温
19、度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。取 3 支试管，编号后按下表加入试剂： 摇匀后，将 1 号、3 号两试管放人 37恒温水浴中，2 号试管放人冰水中。10分钟后取出，(将 2 号管内液体分为两半 )用碘化钾碘溶液来检验 1、2、3 管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将二号管剩下的一半镕液放人 37水浴中继续保温 10 分钟后，再用碘液实验，结果如何？ （二） pH 对酶活力的影响实验原理1 原理 酶的活力受环境 pH 的影响极为显著；不同酶的最适 pH 值不同。本实验观察pH 对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适 pH 约为 6.8。 实验
20、器材及试剂器材： 试管及试管架、吸管、滴管、50 毫升锥形瓶、恒温水浴。 试剂： (1)新配制的溶于 0.3氯化钠的 0.5淀粉溶液 (2)稀释 50 倍的新鲜唾液 (3)0.2 摩尔升磷酸氢二钠溶液 (4)0.1 摩尔柠檬酸溶液 (5)碘化钾碘溶液 (6)pH 试纸：pH5、pH58、pH 68、PH8 四种 实验步骤 1.取 4 个标有号码的 50 毫升锥形瓶。用吸管按下表添加 0.2 摩尔升磷酸氢二钠溶液和 0.1 摩尔升柠檬酸溶液以制备 pH50 一 80 的四种缓冲液。 2.从四个锥形瓶中各取缓冲液 3 毫升，分别注入 4 支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加 0.5淀粉溶液 2
21、 毫升和稀释 50 倍的唾液 2 毫升。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为 1 分钟。将各试管内容物混匀，井依次置于 37恒温水浴中保温。 3.第四管加入唾液 2 分钟后，每隔 I 分钟由第 3 管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加 1 小滴碘化钾碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加 12 滴碘化钾 碘溶液。添加碘化钾碘溶液的时间间隔，从第一管起，亦均为 1 分钟。 4.观察各试管内容物呈现的颜色，分析 pH 对唾液淀粉酶活性的影响。 （三）唾液淀粉酶的活化和抑制实验原理酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。 实验器材及试
22、剂器材： (1)恒温水浴 (2)试管及试管架 试剂： (1) 0.1淀扮溶液 (2)稀释 50 倍的新鲜唾液 (3)1氯化钠溶液 (4)1硫酸铜镕液 (5)1%硫酸钠溶液 (6)碘化钾碘溶液 实验步骤 （四）酶的专一性实验原理酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。 淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解，蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解，用 Benedict 试剂检查糖的还原性。 实验器材及试剂 器材： 恒温水浴、沸水浴、试管及试管架 试剂： (1)2蔗糖溶液 (2)溶于
23、 0.3%的氯化钠的 1淀粉溶液 (需新鲜配制)(3)稀释 50 倍的新鲜唾液 (4)蔗糖酶溶液(5)Benedict 氏试剂 实验步骤思考题 1.什么是酶的最适温度及其应用意义？ 2.什么是酶反应的最适 pH？对酶活性有什么影响？ 3.什么是酶的活化剂？ 4.什么是酶的抑制剂？与变性剂有何区别？ 实验七 底物浓度对酶促反应速度的影响 米氏常数的测定实验目的1.了解底物浓度对酶促反应的影响。 2.掌握测定米氏常数 Km 的原理和方法。 实验原理酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示： 式中，v反应初速度（微摩尔浓度变化/min） ； V最大反应速度（微摩尔浓度变化/min ） ； S底
24、物浓度（mol/L） ； Km米氏常数（mol/L） 。实验原理这个方程表明当已知 Km 及 V 时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。Km 值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。不同的酶Km 值不同，同一种酶与不同底物反应 Km 值也不同， Km 值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km 值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。测 Km 值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的 Km值在 0.01100mmol/L。Linewaeaver Burk 作图法（双倒数作图法）是用实验方法测 Km 值的最常用的简便方法： 本实验以胰蛋白酶消化 酪蛋白为例，采用 Linew
25、aeaverBurk 双倒数作图法测定 Km 值。 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和 L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。 实验器材及试剂器材： 50mL 三角瓶、150mL 三角瓶、吸管 5mL，10mL、量筒 100mL、25mL 碱式滴定管及滴定台、蝴蝶夹、恒温水浴、滴管试剂： 1040g/L 酪蛋白溶液（pH8.5 ） 、中性甲醛溶液、 0.25%酚酞加 50%乙醇溶液、标准 0.1M NaOH 溶液、胰蛋白酶溶液 实验步骤取 50mL 三角瓶 4 个，加入 5mL 甲醛与 1 滴酚酞，以 0
26、.1M 标准 NaOH 滴定至微红色，4 个瓶颜色应当一致，编号。 2量取 40g/L 酪蛋白 50mL，加入一 150mL 三角瓶，37保温 10 分钟，同时胰蛋白酶液也在 37保温 10 分钟，然后吸取 5mL 酶液加到酪蛋白液中。 （同时计时！）充分混合后立即取出 10mL 反应液（定为 0 时样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1 号）加 10 滴酚酞；以 0.1M NaOH 滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，按耗去的 NaOHmL 数，每 mL 加一滴酚酞，再继续滴至终点，记下耗去的 0.1M 标准 NaOH mL 数。 2 分钟、4 分钟、6 分钟时，分别取出 10mL 反应液，
27、加入 2 号、3 号、4 号小三角瓶，同上操作，记下耗去 NaOH mL 数。 以滴定度（即耗去的 NaOH mL 数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度为V40（相对于 40g/L 的酪蛋白浓度） 。 4.然后分别量取 30g/L、20g/L、10g/L 的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。 利用上述结果，以 1/v 对 1/s作图，即求出 V 与 Km 值。 3在 （1）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定 pH 及温度下部分失
28、活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。 （2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。 思考题1.试述底物浓度对酶促反应速度的影响。 2.在什么条件下，测定酶的 Km 值可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？ 3.米氏方程中的 Km 值有何实际应用？ 实验十三小麦萌发前后淀粉酶活力的比较实验目的 1学习分光光度计的原理和使用方法。2学习测定淀粉酶活力的方法。3了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化实验原理休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸
29、胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。实验器材及试剂器材： 离心机、离心管、研钵、电炉、容量瓶、恒温水浴、20mL 具塞刻度试管、试管架、刻度吸管、分光光度计 试剂： 小麦种子、标准麦芽糖溶液（1mg/mL） 、pH 6.9， 0.02molL 磷酸缓冲液、1淀粉溶液、1 3，5-二硝基水杨酸试剂、1氯化钠溶液、海砂实验步骤1种子发芽 小麦种子浸泡 2.5 小时后，放入 25恒 温箱内或在室温下发芽。2酶液提取 取发芽第 3 或第 4 天的幼苗 15 株，放入乳钵内，加海砂 200 mg，加 1氯化钠溶液 10 mL，用力磨碎。在室温下放置 20 分钟，搅拌几次。然后将提取液离
30、心（1500 rmin）67 分钟。将上清液倒入量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，用缓冲液将酶提取液稀释 10 倍。取干燥种子或浸泡 2.5 小时后的种子 15 粒作为对照（提取步骤同上） 。3酶活力测定（1）取 25mL 刻度试管 4 支，编号。按下表要求加入各试剂（各试剂须在25预热 10 分钟将各管混匀，放在 25水浴中，保温 3 分钟后，立即向各管中加入103 ， 5-二硝基水杨酸溶液 2 mL。（2）取出各试管，放入沸水浴中加热 5 分钟。冷至室温，加水稀释至25 mL。将各管充分混匀。（3）用空白管作对照：在 A500nm 处测定各管的光吸收值。 4计算根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A 标准 /B 未知 =C 标准 /C 未知 式中：c 为浓度；A 为光吸收值。本实验规定：25时 3 分钟内水解淀粉释放 1mg 麦芽糖所需的酶量为 1个酶活力单位。则 15 粒种子或 15 株幼苗的总活力单位=c 酶 n 酶 V 酶 式中：c 酶 为酶液中麦芽糖的浓度； n 酶 为酶液稀释倍数；V 酶 为提取酶液的总体积。 思考题 1为什么此酶提纯整个过程在 05条件下进行？而测酶活力时要在25预保温？反应后又放入沸水浴中？ 2实验结果说明什么？
