1、课题1 微生物的实验室培养,专题2 :微生物的培养与应用,微生物包括,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,一、基础知识： (一)微生物,是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称,病毒：动物病毒、植物病毒、细菌病毒,病毒,SARS冠状病毒、 禽流感病毒,朊病毒（蛋白质病毒）,病毒的增殖：,常见的三种细菌典型形态 球菌、杆菌、弧菌,原核生物：一藻二菌三体,细菌的营养类型,根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。 自养菌:异养菌:腐生菌、寄生菌,光能自养型:光合细菌 化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌,一、细菌,基本结构：特殊结构：,细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核,荚膜、鞭毛
2、、菌毛、芽孢等,细胞壁：肽聚糖；与细菌的致病能力有关；溶菌酶作用对象。,荚膜：细胞壁外多糖类物质或称为粘液层；荚膜与致病菌的致病力有关。（如S型肺炎双球菌）,鞭毛：主要用于运动，数目多少不一。,1.细菌的结构,纤毛：比鞭毛短、直、细，主要用于细菌之间的粘附或附着于宿主细胞。菌毛：数量少，参与细菌的接合，也是噬菌体入侵的受体。,质粒：环状DNA小分子，通过接合作用，质粒可以在不同细胞之间迁移，使质粒上的耐药性基因可以在细菌之间传播，质粒可用作基因工程的载体。,细胞膜、拟核、核糖体,3.细菌的生殖方式：,2.细菌的形态：,4.细菌的休眠体芽孢,杆菌、球菌、弧菌、 螺旋菌,分裂生殖,有些细菌在一定的
3、条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.,芽孢休眠体，不是繁殖体,孢子生殖细胞,5.细菌的群体特征,由单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度后，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体叫菌落。 菌落是鉴定菌种的重要依据。,菌落,菌落的大小、形状、边缘状况、质地、光泽、颜色及透明度等是微生物分类、鉴定的重要依据。菌苔：固体培养基表面众多菌落连成一片，呈片状，这就是菌苔。平板：即培养平板，指盛有固体培养基的平
4、皿,各种类型的细菌菌落,二、放线菌,1、结构： 单细胞原核 分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）,如：链霉素、土霉素、四环素、 氯霉素、红霉素、庆大霉素,微生物中发现了几千种抗生素， 其中2/3是由放线菌产生的。,应用:,三、真菌（真核细胞）,1.单细胞真菌酵母菌：,酵母菌、霉菌、大型真菌（蘑菇、木耳等）,三、真菌（真核细胞）,2.丝状真菌霉菌,直立菌丝 营养菌丝,腐生生活,各种类型的霉菌菌落,酵母菌和霉菌,青霉,3.大型真菌,各种类型的放线菌菌落,各种类型的酵母菌菌落,四大类微生物区分要点 菌落形态： 1.若菌落表面湿润 薄而小细菌 厚而大酵母菌 2.若菌落表面干燥 密而小放线菌 松而大霉菌,
5、细菌：湿润，粘稠，易挑起 放线菌：干燥，多皱，难挑起，菌落较小，多有色素酵母菌：湿润，粘稠，易挑起，表面光华，比细菌的菌落大而厚.霉菌：菌丝细长，菌落疏松，成绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状，无固定大小，多有光泽，不易挑起。,不同微生物菌落的特点,同类微生物的不同物种，菌落的特点也不相同。,原生生物界：,藻类、原生动物类、原生菌类,草履虫,微生物的种类,有细胞结构,没有细胞结构,原核生物 （原核细胞构成）,真核微生物 （真核细胞构成）,真菌原生生物,病毒,微生物的共同特点 （小、多、快、强、广）,（1）体积小，面积大 （细胞以微米、纳米来计算） （2）吸收多，转化快 （3）生长旺，繁殖快 如大肠杆菌
6、（4）适应强，易变异 如感冒病毒 （5）分布广，种类多,（二）培养基,人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,按成分分 按功能分 按物理状态分,培养基类型,合成培养基 天然培养基,基本培养基 选择培养基 鉴别培养基,固体培养基 液体培养基 半固体培养基,分类：,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,A.合成培养基:,天然培养基与合成培养基,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋
7、白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原蛋白等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。半合成培养基,天然培养基:有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染。,B.天然培养基：,A.鉴别培养基利用细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，观察细菌生长过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的反应不同来鉴
8、别细菌。例如 伊红-美蓝培养基鉴别水中大肠杆菌(带金属光泽深紫色菌落）；又如：淀粉培养基可通过培养基上产生淀粉水解圈，鉴别产淀粉酶菌株,鉴别培养基与选择培养基,B.选择培养基在培养基中加入抑制剂，去抑制标本中的杂菌生长，有助于对所选择的细菌种类的生长。如：利用以纤维素或石蜡油为唯一碳源的选择培养基，可分离出分解纤维素或石蜡油的微生物。又如：加入青霉素、四环素或链霉素的选择培养基，可以抑制细菌和放线菌的生长，而将酵母菌和霉菌分离出来。,鉴别培养基与选择培养基,加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加有机物的
9、培养基: 分离自养型微生物,A.液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,固体培养基与液体培养基,B固体培养基：菌落，菌苔,B.半固体培养基：,无动力 有动力(弥散),(是否运动),培养基的用途,液体培养基： 固体培养基： 半固体培养基： 天然培养基： 合成培养基： 选择培养基： 鉴别培养基：,增菌、工业生产,分离、鉴定、计数、保藏,观察运动、分类、计数,工业生产,分类、鉴定,分离出特定微生物,鉴别不同种类的微生物,培养基的成分 各种培养基的共有成分 水、碳源、氮源、 无机盐等营养物质。,不同微生物所需要的特殊成分 微生物生长对pH、特殊营养物质,以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。 例
10、如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶),（三）无菌技术,1.无菌技术的概念,无菌技术泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,成功地培养微生物的关键。,（）消毒定义：利用较为温和的化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。分为高程度消毒 、中程度消毒、低程度消毒三种方式。,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,（2）灭菌的定义：,以强烈的化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消
11、毒法：70-75 下煮30min或80 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用70%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 ,(1)消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,1、灼烧灭菌,(2)灭菌的方法：,2、干热灭菌： 160-170 下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌： 100kPa、121 下维持15-30min.,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也
12、可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。,无菌技术,微生物实验室培养的基本操作程序,1、培养基的配制 2、器具、培养基的灭菌 3、倒平板 4、微生物接种 5、恒温箱中培养 6、菌种的保存,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,旁栏思考,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,旁栏思考,三、实验
13、操作,（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）,1计算、称量 2溶化 3调pH： pH7.6 4过滤：这一步可以省去。 5分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装锥形瓶的量以不超过锥形瓶容积的一半为宜。 6加塞 7包扎,操作 步骤,8灭菌:将100ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。,9倒平板:待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染
14、才可用来接种. 10无菌检查：将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 也可以避免空气中
15、杂菌对培养基的污染.,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,（二）纯化大肠杆菌,接种方法有： 平板划线法和稀释涂布平板法,微生物的接种技术：,平板划线的操作方法 交叉划线法 连续划线法,5,1,2,3,4,平板划线的操作,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上
16、次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,稀释涂布平板法,把菌液进行一系列
17、梯度稀释,然后将不同稀释度 的菌液分别涂布到固体培养基上进行培养。在 稀释度大的菌液里,就会出现单个菌体形成的 菌落,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,菌种的保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法,当培养基冷却至50 左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适
18、，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 （二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符,合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。 （三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学
19、生良好的科学态度与习惯。,【典例解析】,例1关微生物营养物质的叙述中，正确的 A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,答案：D,解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl
20、则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是 A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌 C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前,答案：B,解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答： （1）右表培养基可培养的微生物类型是 。 （2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。 如不想浪费此培养基，可再加入 。,自养型微生物,含碳有机物,（3）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。 （4）表中营养成分共有 类。 （5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。 （6）右表中各成分重量确定的原则是 。 （7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分 。,固氮微生物,3,调整pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,
