1、5.1 DNA的粗提取与鉴定,第一部分：预习完成相关基础知识,一、基础知识,（一）提取DNA的方法,1.提取生物大分子的基本思路,选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,2.提取DNA的基本思路,提取DNA，去除其他成分;利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等;在物理和化学性质方面的差异, DNA的溶解性,DNA和蛋白质等成分,在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,利用这一特点，选择适当的盐浓度,就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀；,或者让其他成分溶解,DNA析出,3.DNA等大分子的理化性质,DNA不溶于酒精溶液， 但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 将DNA与蛋白质进一步
2、分离。, DNA不溶于酒精溶液, DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性, 蛋白酶水解蛋白质，对DNA没有影响, 高 温大多数蛋白质不能忍受6080而DNA在80以上才会变性, 洗涤剂溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质但对DNA没有影响,1、试剂：,（二）DNA的鉴定,条件：,二苯胺,沸水浴条件下， DNA遇二苯胺被染成蓝色,沸水浴,现象：,甲基绿 （绿色）,想一想 必修1还有什么可鉴定DNA？,第二部分：实验操作,（一）实验材料的选取,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,（三）除去滤液中的杂质(纯化),（四） DNA的析出与鉴定,二、实验设计,视频播放,难点：实验操作过程,（一）实验材料的选取,1、材料
3、：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）,2、原则：选用DNA含量相对较高、容易提取的生物组织。,鸡血,3、合适的材料：,从核DNA数目来看，猪38条，鸡78条，哺乳动物血0条，猕猴桃58条，洋葱16条，豌豆14条，菠菜12条，大肠杆菌1条。,鸟类的血细胞核大，DNA多 不需要破除细胞壁 哺乳动物的血细胞无细胞核及细胞器。 液体培养基中的大肠杆菌的DNA量较少。,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞,容易破碎,鸡血细胞溶液： 加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌， 过滤后收集滤液,想一想：为
4、什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂；加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出DNA,经研磨可破碎细胞壁，使细胞核内的DNA释放。若研磨不充分，会使提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。,想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,1. DNA的溶解性,（三）除去滤液中的杂质,方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，在用2m
5、ol/L的NaCl溶液溶解DNA。,为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,（四） DNA的析出与鉴定,与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95)，静置23min，溶液中会出现白色丝状物粗提取DNA用璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,1、DNA的析出,1. DNA的溶解性,2. DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,（三）除去滤液中的杂质,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,方
6、案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA 与蛋白质分开； 方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同， 使蛋白质变性，与DNA分离,（四） DNA的析出与鉴定,与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95)， 静置23min，溶液中会出现白色丝状物粗提取DNA 用玻璃棒沿一个方向搅拌， 卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,1、DNA的析出,2. DNA的鉴定 二苯胺, 向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液5ml 其中一支试管中加入DNA丝状物 各加入二苯胺试剂4ml 混匀后，置于沸水浴中加热5min 待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化观察现象：,溶解丝状物的溶液变为蓝色,
7、实验操作,4、课前准备鸡血细胞液,取质量浓度为01g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）,过程,柠檬酸钠作用,防止血液凝固,作用机理,柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固,鸡血细胞破碎以后释放出的
8、DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液,注意事项,讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆,5、方法步骤,将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。,提取鸡血细胞的细胞核物质,讨论：,答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破,（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会
9、有什么变化？,（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？,答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA,（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA,溶解细胞核内的DNA,将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态,沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加
10、时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 molL）,析出含DNA的粘稠物,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出,将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕,注意事项：,滤取含DNA的粘稠物,用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上,将DNA的粘稠物再溶解,取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝
11、头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中,提取含杂质较少的DNA,在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：,（2）观察
12、丝状物呈什么颜色？,答：白色,（1）为什么要加50mL的冷酒精？,取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0015 molL的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化, DNA的鉴定,讨论：,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（2）这一鉴定结果说明什么问题？,（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是DNA,（3） DNA的直径约为2010-10 m，实验中出现的丝状物的粗细
13、是否表示1个DNA分子直径的大小？,答： DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的,八个步骤,1.制备鸡血细胞液，提取鸡血细胞核物质 2.溶解细胞核内DNA 3.析出DNA粘稠物 4.滤取DNA粘稠物 5.将DNA粘稠物再溶解 6.过滤含DNA的NaCL溶液 7.提取含杂质少的DNA 8.DNA的鉴定,加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固,加速血细胞破裂,溶解DNA,使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA最大限度地释出,使含DNA的黏稠物被留在纱布上,使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中,除去含DNA的滤液中的杂质,提取DNA, A出现蓝色 B无
14、变化,（二）案例二：以菜花为实验材料进行DNA的粗提取,1、课前准备,将新鲜菜花和体积分数为95的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24 h,2、提取DNA的具体步骤,取材：称取30 g菜花，去梗取花，切碎,研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min,过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000 r/min的转速，离心25 min，取上清液放入烧杯中)。在4 冰箱中放置几分钟后，再取上清液,沉淀：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部
15、)。沉淀35 min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上,观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备,四、课题成果评价,（一）是否提取出了DNA,本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质,（二）分析DNA中的杂质,（三）不同实验方法的比较,对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺
16、显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好,答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”,6、讨论：,两次蒸馏水,第一次：细胞吸水胀破 第二次：使 DNA黏稠物析出,（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？,过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层,三次过滤,第一次： DNA存在于滤液里 第二次： DNA被留在纱布上 第三次： DNA存在于滤液里,两次析出,第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含杂质多,第二次：用冷却的95
17、的酒精,课后思考：六次搅拌？,其中除最后一次外，其余均要朝一个方向搅拌，要保证得到完整的DNA，在搅动还要轻缓。玻璃棒不要直插烧杯底部，以免弄破烧杯。,1、在制备鸡血细胞液的过程中，加入柠檬酸钠的目的是（ ） A .防止凝血 B. 加快DNA析出 C .加快DNA溶解 D.加速凝血,练一练,A,2、DNA的溶解度最低时，NaCl的物质的量浓度为（ ） A 2mol/l B 0.1mol/l C 0.14mol/l D 0.015mol/l 3、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（ ） A 加快DNA溶解的速度 B 加快溶解杂质的速度 C 减小DNA的溶解度，加快DNA析出
18、D减小杂质的溶解度，加快杂质的析出,C,C,4、向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中不断加入蒸馏水,在这个过程中DNA的溶解度变化情况分别是 A 减小;减小 B 增大;增大 C 先减小后增大 D增大; 减小 5、欲使溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，最有效的办法是 A 加蒸馏水 B 加矿泉水 C 加清水 D 加生理盐水,6、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是 A 操作时缓慢滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度 B 操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整 C 加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度 D 当丝状粘稠物不再增加时，NaCl溶液的浓度可以认为是0.14
19、mol/L,7、你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗？,用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。,8、DNA遇二苯胺会染成（沸水浴） A 硅红色 B 红色 C 紫色 D 蓝色,D,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白质分开；方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性，与DNA分离,方案二、直接在滤液中加入嫩肉粉，反应1015分钟。方案三、将滤液放在60750C的恒温水浴箱中保温1015分钟。,2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,练习,1、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。,答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一
20、定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。,2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗？,答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。,
