1、1专题 2 微生物的分离与培养课题 1 微生物的实验室培养 导学案编写：韩志涛 审核：詹 翔【课程目标】了解培养基的基础知识，进行微生物培养和无菌技术的操作【课题重点】无菌技术的操作【课题难点】无菌技术的操作【知识链接】一、培养基1概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质叫培养基。可分为 培养基和 培养基。 2营养构成：各种培养基一般都含有 、 、 和 ，此外还要满足微生物生长对 、 以及 的要求。 3培养乳酸杆菌时需在培养基中添加 、培养霉菌时需将培养基 PH 调至 、培养细菌时需将 PH 调至 、培养厌氧微生物则需提供 条件。思考 1从细胞的化学元素组成来看，培养基中为什
2、么都含有这些营养成分？二、无菌技术(一)获得纯净培养物的关键是 ，具体操作如下：1对实验操作的 、操作者的 和 进行 。2将用于微生物培养的 、 和 等器具进行 。3为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 附近进行。4实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与 相接触。(二)消毒和灭菌1消毒是指 。常用的方法有 、 、 消毒法。2灭菌是指 。常用的方法有： 、 、 灭菌。分别适用于那些用具？思考 2无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是什么？思考 3利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是什么？思考 4物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气
3、，其目的是 ；随后关闭排气阀继续加热，气压升至 ，温度为 ，并维持 min；最后切断热源，使温度自然降温，气压务必降至 时打开锅盖，其目的是防止 。三、实验操作-大肠杆菌的纯化培养：（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的操作步骤是 、 、 、 。2思考 5在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的称量操作中，动作要迅速，原因是什么？溶化操作中需要不断用玻璃棒搅拌的目的是什么？思考 6牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供什么等营养物质？2、倒平板：待培养基冷却至 左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：在火焰旁右手拿 ，左手 ；使锥形瓶的瓶口 ；左手将培养皿 ，右手 ，立刻盖上皿盖。待
4、平板冷却凝固后，将平板 。思考 7锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是什么？思考 8平板倒置的目的是什么？思考 9若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？思考 10配制斜面培养基作用是什么？，试管为什么要加塞棉塞？（二）纯化大肠杆菌微生物接种：最常用的是 法和 法。另外还有穿刺接种和斜面接种等。1、平板划线法是 的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。其操作步骤是：将 在酒精灯火焰上灼烧直至 。在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。将菌种试管口通过火焰达到 的目的。将冷却的接种环伸入到 。将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。将皿盖打开一条缝隙，把接种环
5、，盖上皿盖，不要划破培养基。灼烧接种环，冷却后从 划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将 相连。将平板 培养。思考 11取菌种前灼烧接种环的目的是什么？为什么除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环？ 取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是？最后灼烧接种环的目的是？在第 1 次划线后都从上次划线末端开始的目的是？2、稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将 进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。系列稀释操作：取盛有 mL 水的无菌试管 6 支 ，编号 101、10 2、10 3、10 4、10 5、10 6。用灼烧冷却的移液管吸取
6、mL 菌液注入编号为 101试管中，并吹打 3 次使之混匀。从 101倍液中吸取 mL 菌液注入到编号为 102试管内吹打均匀，获得 102倍液。依此类推。思考 12在培养基上出现了 3 种特征不同的菌落可能是什么原因？3基础自测一、选择题1下列有关培养基的叙述正确的是( )A培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B培养基只有两类：液体培养基和固体培养基C固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基D微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌2不同培养基的具体配方不同，但一般都含( )A碳源、磷酸盐和维生素 B氮源和维生素C水、碳源、氮源和无机盐 D碳元素、氧元素、氢元素、氮元素3下
7、列常用的无菌操作中错误的是( )A用酒精擦拭双手 B用氯气消毒水源C实验操作应在酒精灯火焰附近进行 D玻璃器皿(吸管、培养皿)可用酒精擦拭4有关倒平板的操作错误的是( )A将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上 B使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰C将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌子上 D等待平板冷却凝固后需要倒过来放置5有关平板划线操作正确的是( )A使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌B打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞C将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可D最后将平板倒置，放入培养箱中培养6有关稀释涂布平板法，叙述错误的是( )A首先将菌液进行一系
8、列的梯度稀释B然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面C再放在适宜条件下培养 D结果都可在培养基表面形成单个的菌落7涂布平板操作需要用到( )A接种环、滴管、酒精灯 B接种环、移液管、酒精灯C涂布器、移液管、酒精灯 D涂布器、接种环、酒精灯8将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入 37恒温箱的目的是( )A对比观察培养基有没有被微生物利用 B对比分析培养基是否被杂菌污染C没必要放入未接种的培养基 D为了下次接种时再使用9关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ）A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量10菌种
9、长期保藏应控制的条件一般是（ ）湿度 低温 干燥 有光 隔绝空气 适当有氧A B C D11下列物质中，不能用作酵母菌碳源的是（ ）A含碳有机物 B蛋白胨 C含碳无机物 D花生粉饼等天然物质12平板冷却凝后要将平板倒置，其意义是（ ）A利于大肠杆菌的接种 B防止杂菌污染 C利于培养的冷却 D防止皿盖冷却水倒流入培养基413下列措施中不属于消毒的是（ ）A酒精擦拭双手 B向水中通入少量 Cl2 C皮肤受伤处涂紫药水 D灼烧接种环14关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述错误的是（ ）A操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 B将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯C等培养基冷却至 500C 左右时
10、进行倒平板 D将平板冷却凝固 5-10 分钟后将平板倒过来放置15为了保持菌种的纯净需要进行菌种的保藏，下列有关叙述不正确的是( )A对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法 B临时保藏的菌种一般接种到试管的斜面培养基上C临时保藏的菌种容易被污染或产生变异 D对于需要长期保存的菌种，可以采用低温-4 0C 保藏的方法二、填空题16.（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑 、 和渗透压等条件。（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行 处理（消毒、灭菌），其中对培养皿进行灭菌常用的方法是 ；操作者的双手需要进行清洗 。（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆
11、菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的 。（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的 。（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是 。（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过 处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。17炭疽病是由炭疽杆菌引起的一种人畜共患传染病。炭疽杆菌两端截平、呈竹节状排列，菌落呈卷发状。对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的宿主专一性，通过实验确诊。（1）细菌培养：采集疑似患者的样本，分离培养，获得可疑菌落。（2）细菌鉴定：实验
12、流程如下图所示。对配制的液体培养基等需采取 方法灭菌；实验所用液体培养基的碳源为 （填“无机碳”或“有机碳” ） 。挑选可疑菌落制片后，用 观察，可看到呈竹节状排列的杆菌。接种可疑菌后，35培养 24 小时，液体培养基变浑浊，原因是 。对照组试管中应加5入 ，与实验组同时培养 6 小时后，若实验组液体培养基的浑浊度比对照组 （填“高”或“低” ） ，则可明确疑似患者被炭疽杆菌感染；反之则排除。巩固练习1固体培养基中需要加入琼脂的目的是( )A为菌体提供碳源 B为菌体提供氮源 C使培养基保持水分 D使培养基凝固2下列关于灭菌的说法中，错误的是( )A灭菌是指杀死一定环境中所有微生物的细胞，不包括
13、芽孢和孢子B对不同的生物材料，应当采取不同的灭菌方法C培养基一般采取高压蒸汽灭菌法D高压蒸汽灭菌法最终使菌体蛋白质凝固变性3制备牛肉膏蛋白胨固体培养基时，关于倒平板的具体描述正确的是( )待培养基冷却至 40左右时，在酒精灯火焰附近倒平板将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰用左手的拇指和食指完全打开皿盖右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖等待平板冷却 510s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上A B C D4煮沸消毒法与巴氏消毒法的主要区别是( )A温度不同 B时间不同C前者适用于固体消毒，后者适用于液体消毒 D没有区别5培养基、培
14、养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶采用的灭菌、消毒方法依次是( )化学消毒 灼烧灭菌 干热灭菌 紫外线灭菌 高压蒸汽灭菌 巴氏消毒法A B C D6外科手术器械和罐头食品的消毒，都要以能够杀死什么为标准( )A球菌 B杆菌 C螺旋菌 D芽孢7在平板划线时，若需多次取菌划线，应在哪次划线时灼烧接种环( )A每次都应灼烧 B只第一次 C每次均不需灼烧 D第一次和最后一次8下列有关一种以 CO2为唯一碳源的微生物营养的描述中，不正确的是( )A氮源物质为该微生物提供必要的氮素B碳源物质也是该微生物的能源物质C无机盐是该微生物不可缺少的营养物质D水是该微生物的营养要素之一9高温灭菌的原理是(
15、)A每种微生物生长的最适温度是一定的B微生物对高温环境不适应C高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动D高温降低了环境中氧的浓度10产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是( )A一个细菌、液体培养基 B许多细菌、液体培养基C一个细菌、固体培养基 D许多细菌、固体培养基11下列关于倒平板及对菌种纯化的说法正确的是( )A倒平板时左手将灭过菌的培养皿盖完全打开,右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿(1020 mL),左手立即盖上培养皿盖B使用已灭菌的接种环,培养基不需要再灭菌6C平板冷凝后要将平板倒置,以防皿盖上的冷却水倒流入培养基D涂布器用火焰灼烧灭菌12某研究小组从有机废水中分离微生物
16、用于废水处理。下列叙述正确的是( )A培养基分装到培养皿后进行灭菌B转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线C接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养D培养过程中每隔一周观察一次13实验时务必注意安全,对此下列叙述不正确的是( )A规范操作,以防被致病微生物感染B规范操作,防火、防烫伤C实验中不能吃东西,但可以说话、喝水,实验后一定要洗手D丢弃前一定灭菌以免污染环境14稀释涂布平板法是微生物培养中常用的一种接种方法。下列相关叙述错误的是( )A操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释B需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面C不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落D操作过程中对培养基和涂布器
17、等均需进行严格灭菌处理15下列有关平板划线接种法的操作错误的是（ ）A将接种环放在火焰上燃烧 B将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液 C蘸取菌液和划线要在火焰旁进行 D. 接种环划线要将最后一区的划线与第一区的划线相连16某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。请回答与此实验相关的问题。（1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了 和 。除此之外,培养基还必须含有的基本成分是 和 。 （2）对培养基进行灭菌,应该采用的方法是 。使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向锅内倒入_，把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后将锅密
18、闭。（3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于 中培养，培养的温度设定在 37。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种 作为对照进行实验。（4）培养 20 小时后,观察到平板上有形态和颜色不同的菌落,这说明湖水样品中有 种细菌。一般说来,菌落总数越多,湖水遭受细菌污染的程度越 。 （5）某同学用平板划线法接种培养后，发现培养基上细菌数目过多地连成一片，可能的原因是什么？17人们常用琼脂培养基来培养微生物，它在加热后呈溶胶状态，在室温下又呈半透明的凝胶状态。在凝胶状态下，其表面及内部不同部位可生长大量的不同代谢类型的肉眼可见的细菌菌落。请用提供的材料和用具，
19、完成下列探究某种细菌是需氧型、厌氧型还是兼性厌氧型的实验。材料用具：某种细菌的菌种、含琼脂培养基的试管 2 支、无菌接种设备、恒温箱、水浴锅。实验步骤：（1）将 2 支含琼脂培养基的试管水浴锅中加热熔化；（2）在培养基冷却而凝固之前，用_将某种细菌菌种接种到一支试管中，_，使细菌均匀混于培养基中，另一只试管_；（3）将 2 支试管置于恒温箱内培养，每天观察培养基中的菌落情况并做好记录。预测实验可能会出现的结果，并得出相应的结论。7. 若 ，则说明它是需氧型；. 若 ，则说明它是厌氧型；. 若 ，则说明它是兼性厌氧型。18检验饮用水中大肠杆菌的含量是有效监控疾病发生的必要措施。下图表示相关的检验
20、过程。（横线上填文字， 内填编号）（1）图中需要无菌操作的过程有 。（2）经过过程，样品被稀释了 倍，其目的是 。（3）在进行过程之间，需要随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的 。接种微生物的方法有很多,图中过程方法为 。下列示意图与过程方法相应的结果是 。（4）用该方法统计样本菌落数时,同时需做 A、B、C 三个培养皿，其原因是 。 19请回答与微生物分离和培养有关的问题:（1）稀释涂布平板法分离纯化土壤中微生物的正确操作步骤是_（填序号） 。为减少误差，在设置平板是一般要_或以上数目平板；若统计出在稀释倍数为 105的平板上的平均菌落数为 30 个，所用稀释液的体积为
21、02ml，则每克样品中的菌落数为_。土壤取样称取 10g 土壤加入盛有 90ml 无菌水的锥形瓶中制备土壤提取液吸取 01ml 溶液进行涂布平板依次稀释至 101、10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7稀释度（2）无菌技术主要通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。其中对培养基和培养皿进行灭菌的常用方法分别是_、_；要求实验操作应在_进行，以避免周围环境中微生物的污染。（3）要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，而寻找耐热菌要从高温热泉中，这说明寻找目的菌的方法是：_。20为从土壤中筛选能有效降解有机化合物 X 的细菌，研究人员用化合物 X、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，
22、成功地筛选出能高效降解化合物 X 的细菌（目的菌） 。下图是从土壤中筛选出该细菌的过程示意图，下表是分离纯化的结果。请回答下列问题：8（1）培养基中的有机化合物 X 主要为目的菌提供 等营养要素。从土壤中富集能有效降解有机化合物 X 的细菌时，应选用 （填“固体”或“液体” ）培养基。（2）配制成 10-1浓度稀释液时，用无菌移液管从富集液的上清液中吸取 1mL，移入盛有_ _ mL 无菌水的试管中，并依次配制 10 -210 -10的梯度稀释液。（3）在分离、纯化过程中，图中、过程接种的方法分别为 、 。在倒平板前，应对玻璃器皿和培养基灭菌，灭菌方法是 。（4）分析菌种的分离纯化结果，应选择
23、为 号菌落进行扩大生产，原因是 。（5）实验过程中还需配制空白培养基作为对照，其目的是 。21请回答下列有关微生物培养和分离的问题。（1）培养微生物时，获得纯洁培养物的关键是 。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 附近进行。采用固体平板培养细菌时，为防止冷凝水影响细菌的生长，需将培养皿 培养。（2）在菌种保藏时，对于我们频繁使用的菌种一般采用临时保藏的方法，但这种方法有两个缺点： ； 。（3）做完实验将培养基倒掉之前，一定要进行 处理。（4）现有 5 种酵母菌的营养缺陷型菌株 1、2、3、4、5，它们不能合成生长所必需的物质 G，已知A、B、C、D、E 都是合成 G 物质的必需中间产物
24、，但不知这些物质合成的顺序， 于是在培养基中分别加入这几种物质并分析了这几种物质对各种营养缺陷型菌株生长的影响结果如下表所示。根据以上结果，推测这几种物质的合成顺序应是 。22高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选了高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图所示。9（1）过程的目的是 ；过程所使用的接种方法是 法。（2）从用途上来说，号培养基属于 培养基，仅以淀粉作为 源；从物理状态上来说，号培养基属于固体培养基，配制时应加入 作为凝固剂。（3）、号培养基配制和灭菌时，灭菌与调节 pH 的先后顺序是 ；一般对配制的培养基采用 法灭菌。（4）部分嗜热菌在号培养基上生长时可
25、释放 分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈；应挑出透明圈 （大或小）的菌落，接种到号培养基。微生物的实验室培 参考答案知识链接一、1营养物质 生长繁殖 液体 固体2水.碳源 氮源 无机盐 PH 特殊营养物质 氧气3维生素，酸性，中性或微碱性，无氧思考 1C、H、O、N、P、S 是构成细胞原生质的基本元素，约占原生质总量的 97以上。二、 （一）防止杂菌污染1空间 衣着 手，清洁和消毒 2器皿 接种用具，培养基，灭菌 3酒精灯火焰 4.周围的物品 （二）1略 巴氏消 酒精 2.略 灼烧 干热 高压蒸气思考 2:防止感染实验操作者 。思考 3避免妨碍热空气流通。思考 4有利于锅内温度升高，10
26、0k Pa，121，1530，零，容器中的液体暴沸，三、 （一）1计算称量溶化灭菌倒平板 思考 5防止牛肉膏和蛋白胨吸收空气中水分。防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。思考 6糖 维生素 和 有机氮250，锥形瓶，拔出棉塞，迅速通过火焰，打开一条缝隙，将培养基倒入培养皿，倒过来放置思考 7消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基。思考 8防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。思考 9不能。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。思考 10增大接种面积，保持通气并防止杂菌感染。（二）平板划线 稀释涂布平板1通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线，接种环，烧红。，消灭试管口杂菌。菌液中取出
27、一环菌种。，伸入平板内划 35 条平行线，第一区划线末端开始向第二区域内，第五区的划线与第一区划线，倒置放在培养箱中10思考 11消灭接种环上的微生物，的目的是消灭接种环上残留菌种，防止高温杀死菌种；防止细菌污染环境和操作者。获得由单个细菌形成的标准菌落。2不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，9mL，灭菌。，1。，1思考 12培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。基础自测15：ACDCD 610：DCBDD 1115：CDDAD16.（1）PH 温度 （2）灭菌 干热灭菌 消毒（3）比例合适 （4）鉴定（5）将未接种的培养基在适宜温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生（6）灭菌1
28、7.高压蒸汽 有机碳 显微镜 细菌大量繁殖 等量生理盐水 低 巩固练习15：DACAA 610：DABCC 1115：CBCCD16 （1）氮源(或氮源、碳源) 碳源 无机盐 水（2）高压蒸汽灭菌 适量水（3）恒温培养箱 无菌水（4）多 大（5）菌液浓度过高；培养过程中被杂菌污染；利用接种针划线时，划下一个区域前没有对接种针进行灭菌处理17 （2）无菌接种设备 振荡试管 不接种作为对照。（3）.只在培养基的表面生长有这种细菌的菌落；.只在培养基的内部生长有这种细菌的菌落；.在培养基的各个部位都有细菌菌落。18 （1）（2）10 5 培养后形成单个菌落 （3）检测培养基平板灭菌是否合格 稀释涂布法 b（4）分别计数 3 次，取平均值，使实验结果更加准确可靠19 （1） 3 个 1510 7个（2）高压蒸汽灭菌 干热灭菌 酒精灯火焰旁（3）到相应生存环境中寻找20 （1）碳源（或碳源、氮源） 液体 （2）9 （3）稀释涂布平板法 平板划线法 高压蒸汽灭菌（4）3 透明圈/菌落越大，降解化合物 X 能力越强 （5）检验培养基的灭菌是否合格1121 （1）无菌操作（防止杂菌污染） 酒精灯火焰 倒置（2）保存的时间不长 菌种易被污染或产生变异（3）灭菌（4）EACBDG22 （1）稀释 稀释涂布平板（2）选择 （唯一）碳 琼脂（3）先调节 pH，后灭菌 高压蒸汽灭菌（4）淀粉酶 大
