1、实验八 大分子物质的水解和糖发酵试验,主 讲:徐尔尼 生命科学学院生物技术系,一、目的与要求证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系。掌握微生物大分子水解试验的原理和方法。了解糖发酵的原理及在肠道细菌鉴定中的重要作用。掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。学习微生物接菌技术。,二、基本原理 1、淀粉水解试验微生物不能直接利用淀粉，必须靠自身产生的胞外淀粉酶将大分子淀粉分解成糊精、双糖和单糖才能进入细胞内，细菌是否能产生淀粉酶可通过观察细菌菌落周围的淀粉物质是否被水解来证实，淀粉遇碘液会产生蓝色，被细菌水解淀粉的区域，用碘则呈褐色。,二、基本原理 2、明胶水解
2、试验微生物不能直接利用明胶这蛋白质，必须靠自身产生的胞外明胶酶将大分子蛋白质水解成蛋白胨或氨基酸才能进入细胞内，细菌能否产生明胶酶可通过明胶穿刺培养来证实，在微生物的明胶酶作用下，明胶失去凝固性，呈液化状态。,二、基本原理 3、糖发酵试验糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定中尤为重要。大肠菌群能在370C培养下，利用乳糖产酸、产气。当产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变为黄色（pH5.2）。当产气时，可通过倒置小倒管内的气泡来判断。,图 糖类发酵试验,三、实验器材 1、菌种：枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 2、培养基： 淀粉培养基 2培养血/
3、每组(5人）明胶半固体培养基 4支试管/每组(5人）乳糖发酵培养液 3支试管/每组(5人）葡萄糖发酵培养液 3支试管/每组(5人） 2、试剂：碘液 3、仪器或其他用具：培养箱、水浴锅、接种环、接种针、酒精灯、无菌培养血等。,四、操作步骤 1、淀粉水解试验 溶化三角瓶内的淀粉培养基 趁热倒入二块无菌培养皿各内约15ml 冷凝后点植法接入普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 贴好标签 平板倒置，370C培养24小时 滴加碘液鉴别有无淀粉水解圈 2、明胶水解试验 取四支明胶试管培养基 用接种针分别穿刺接入普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌，另一支不接菌为空白对照管贴好标签 200C培养
4、35d （或370C培养2d ，取出置冰浴冷却）观察明胶液化情况,四、操作步骤 3、乳糖发酵试验 取三支乳糖蛋白胨培养基 分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌， 另一支不接菌为空白对照管 贴好标签 370C培养24小时 观察产酸、产气情况 4、葡萄糖发酵试验 取三支葡萄糖蛋白胨培养基 分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，另一支不接菌为空白对照管 贴好标签 370C培养24小时 观察产酸、产气情况 操作要点：注意无菌操作，勿染杂菌。接好菌的平板一定要倒置放入培养箱中。,无菌操作技术,五、实验数据及处理结果 1、大分子物质水解试验将结果填入下表。“+”表示阳性，“-”表示阴性,2、糖发酵试验将结果填入下表。“ ”表示产酸产气，“+”表示产酸，“-”表示阴性,六、思考与讨论 1、你怎么解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？ 2、接种后的明胶试管也可以在350C培养，在培养后你必须做什么才能证明水解的存在？,
