1、实验二 细菌的简单染色与革兰氏染色,主 讲:徐尔尼 生命科学学院生物技术系,一、目的与要求 1、学习微生物涂片、染色的基本技术、掌握细菌的简单染色和革兰氏染色方法。 2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 3、掌握无菌操作技术、巩固油镜的使用。,二、基本原理 1、简单染色法简单染色法是使用一种染料对细菌进行染色的方法。常采用碱性染料进行染色，因为碱性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷，很容易与带负电荷的细菌细胞结合使细菌着色。碱性染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。细菌产酸使培养基pH下降时，细菌带正电荷增加，可采用酸性染料。酸性染料有：伊红、酸性复红、刚果红等。,2、革兰氏
2、染色革兰氏染色是采用二种染料对细菌细胞进行染色，初染采用的是结晶紫，复染采用的是番红。 G菌：细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，基本不含类脂，肽聚糖分子交联度较紧密，故经乙醇处理后，肽聚糖网孔因脱水而明显收缩，使壁的通透性降低保留着结晶紫碘复合物，所以复染液番红不能进入,细胞显紫色。 G-菌：细胞壁薄，肽聚糖含量低，类脂含量高，肽聚糖分子交松散，故经乙醇处理后，壁会出现较大的缝隙，细胞透性增大，结晶紫碘复合物易被洗脱出来，再经番红复染后使细胞显红色。,三、实验器材 1、菌种：普通变形杆菌、表皮葡萄球菌 2、染色剂：简单染色液(吕氏碱性美蓝染液)；革兰氏染色液（草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇
3、、番红染液） 3、仪器或其他用具：载玻片、生理盐水、酒精灯、接种环、香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、滤纸等,四、操作步骤 1、简单染色 涂片 加热干燥固定 染色 1min 水洗 干燥 镜检 2、革兰氏染色 涂片 加热干燥固定 结晶紫初染 1min 水洗碘液媒染 1min 水洗 95%乙醇脱色 30sec 水洗 番红复染 1min 水洗 镜检 操作要点：1、加热干燥固定时的温度不要太高，否则细胞壁会受到损伤，细胞变形。2、掌握好乙醇脱色时间。,葡萄球菌,杆菌,五、实验数据及处理结果 1、根据油镜观察结果，绘出普通变形杆菌和表皮葡萄球菌的简单染色形态图。 2、列表简述普通变形杆菌和表皮葡萄球菌的革兰氏染色油镜观察结果（菌的形态、颜色、革兰氏染色反应）。,六、思考与讨论 1、如果你的涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？ 2、革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？下次实验项目：细菌的芽孢染色和鞭毛染色,
