1、实验一、免疫球蛋白的粗提,实验目的：,学习免疫球蛋白的粗提方法 实践IgG分离纯化过程 了解分离纯化抗体的原理,多克隆抗体血清含有多种蛋白质组分，不适用于实验室分析、检测应用。 根据实验目的不同，可按照不同的方法对有效的抗体成分进行分离、纯化。,盐析法原理,水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础， 在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随之降低。 蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。33% （NH4）2SO4为沉
2、淀IgG的最适饱和度。,盐析法沉淀抗原的机理,材料与试剂配制 1动物血清 2硫酸铵饱和溶液硫酸铵 800g850gH2O 1 000ml 加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。 注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。,30.01Mol/L pH7.4 PBS液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO42H2O 15.60g加H2O至 1 000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4
3、12H2O 35.80g加H2O至 1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。40.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。5透析袋（或玻璃纸）。,实验步骤,1.免疫血清 0.5 mL加 0.5mL 生理盐水/PBS 2. 逐滴加入饱和（NH4）2SO4 1 mL（此时为50%饱和度）4，静置 20 min 3. 3000 r/min 离心 20 min取沉淀溶于 2 mL 生理盐水/PBS中 4.逐滴加入饱和（NH4）2SO4 1 mL（此时为33%饱和度） 4，静置 20 min3000 r/min 离心 20 min,重复步骤35，2次 7
4、. 取沉淀溶于0.5 mL 生理盐水中装入透析袋 透析除盐，在常水中透析过夜， 再在生理盐水/PBS中于4透析24h，中间换液数次。 取出放于聚乙二醇浓缩10min，取出打开将提取物放于EP管中，-20摄氏度保纯备用。,注意事项,（1）.盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中的速度和方式，边加边缓慢摇动，并避免产生气泡。 （2）.注意区别前后2次盐析所采用的饱和硫酸铵的终浓度。,作业与思考题：,1，常用的分离、纯化免疫球蛋白的方法主要有那几种？各自得到的纯度如何？ 2，五类免疫球蛋白分离纯化的方法皆相同吗？ 3，分离纯化IgG时，为什么硫酸铵的饱和度先调至50%，然后调至33%？加入硫酸铵溶液时，为什么要一滴滴地加？,IgG的纯度鉴定 可采用下列方法之一鉴定。 区带电泳 琼脂双相双扩散鉴定 免疫电泳鉴定 圆盘电泳鉴定,
