1、实验九 正交法测定几种因素对 蔗糖酶活力的影响,目的要求1.初步掌握正交实验设计方法的使用2.求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值,实验原理,酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如：底物浓度、酶浓度、溶液的pH值和离子浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响催化反应的速度。通常是在其他因素恒定的条件下，通过对某因素在一系列变化条件下的酶活性测定，求得该因素对酶活力的影响，这是单因素的简单比较法。本实验用正交法测定温度、pH值、底物浓度和酶浓度四种因素对蔗糖酶活性的影响。,正交法是通过正交表安排多因素实验，利用统计数学原理进行数据 分析的一种科学方法，它符合“以尽量少的试验，获得足够的
2、、有效的信 息”的实验设计原则。正交试验法的程序为下列八个步骤： 1、确定试验目的。实验目的是多种多样的，如找出产品质量指标的最佳组合、确定最佳工艺条件等。本实验的目的是为了提高酶的反应速度，提高酶的活力。 2、选择质量特性指标。应选择能提高或改进的质量特性及因素效应。对于本实验来说就是产物（葡萄糖）生成量的多少。 3、选定相关因素。即选择和确定可能对实验结果或质量特性值有影响的那些因素，可人为控制与调节的因素，如温度、pH等。这些因素之间有相互独立性。 4、确定水平。水平，又称位级，是因素的一个给定值或一种特定的措施，或一种特定的状态。水平也就是因素变化的各种状态。在确定水平时，应考虑选择范
3、围、水平数和水平位置。如本实验的温度水平可以选择25、30 、50 三个水平。,5、选用正交表。应从因素数、水平数以及有无重点因素需要强化考察等各方面综合考虑选用正交表。一般情况下，首先根据水平数选用2或3系列表，然后，以容纳试验因素数，选用实验次数最少的正交表。如有重点考察的因素，则根据其多考察的水平数，选混合型正交表。 6、配列因素水平，制定实验方案。按随机原则，把因素配列于选用的正交表中，制定实验的顺序、时间等，即制定实验具体方案。 7、实施实验方案。按实验方案，认真、正确地试验，如实记录各种实验数据。 8、实验结果分析。对实验中取得的各种数据进行分析。如从数据中直接选出符合或接近质量特
4、性期望值的实验条件组。如不能采用直观分析方法，则应采用其他分析方法，确定各因素主次地位可用极差分析方法，定量分析各个因素对实验结果的影响程度，则用方差分析方法。,实验步骤,1、实验设计：（1）确定指标：即实验的结果。本实验的指标是酶活 力。这里，用A520值表示。（2）制定因素水平表：水平是因素变化的范围（通常是根据专业知识确定。如无资料可借鉴，应先加宽范围再逐步缩小）内要进行实验的具体条件，如下表1。,表1：因素水平表,（3）选择正交表：可容纳三因素三水平的正交表有L9（34）、L27（313）、L18（366）和L27（389）。本实验不考察各因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数
5、均为3的的四个因素，故选用L9（34）表，见下表2。,表2 ：正交表L9（34）,表3：实验安排,准确反应5分钟，加2 ml二硝基水杨酸，沸水浴5分钟，冷水冲3分钟，加入9ml蒸馏水，以对照管（1、2等）调“0”测A值。,（4）实验安排:根据因素和各因素的水平条件设计实验，见表3。,2、具体操作步骤,（1）将已配制好的三种不同pH的0.2mol/L的缓冲液于试管中。 （2）将酶粉用蒸馏水溶解,离心去除不溶物，10,000rpm/min离心10min，4。 （3）酶活预示实验，确定酶的稀释倍数。A520在1-2之间即可。 为什么？ （4）准备18支试管。其中九支为对照管，作为测量时的参 比溶液。
6、其他九支试管根据前面的图表3加入相关的溶液，分别在不同的条件下进行酶反应。利用二硝基水杨酸的方法测定不同管在A520下的光密度值。,（1）数据记录：将上述两组平行实验的结果取平均值后的9个数据，填入表4。 （2）数据整理及分析：对于一般的实验，可用极差分析，该分析方法简单、直观。对要求精细的实验，则要用方差分析，该方法可给出误差的大小估计，但有一定计算量。对于有混合水平的正交实验，只能用方差分 析。本实验，只使用极差分析。,3、数据记录和分析,表4：数据的计算整理,讨 论,1.根据上述的计算结果，画出各因素的趋势图以判断各因素的水平范围是否选偏； 2.对从9次实验结果中选出的较好实验条件、根据计算比较选出的优水平组合和综合比较后设计的较好方案，进行验证实验（今天不做，以后的科研中要做）。 3.由上述数据分析及验证实验，讨论在本实验条件下，温度、pH值、底物浓度和酶浓度对蔗糖酶活性的影响；求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值。,思 考 题,1.正交试验设计法与简单比较法及全面试验法相比较，有何优缺点？ 2.设计实验方案时应遵循什么原则？,
