1、血小板的研究进展,苏州大学附属第一医院 江苏省血液研究所 阮长耿,一、血小板黏附、活化在血栓形成中的重要性,在生理性止血及动脉血栓形成过程中，血小板粘附到暴露的血管内皮下基质并发生血小板活化是血栓形成的起始阶段，进而产生血小板聚集和释放反应，最终导致血小板血栓形成。 现状：参与黏附的相关分子的结构、信号传导以及这些分子 缺陷所引起的临床疾病和症状；进展：vWF-A1/GPIb, vWF-A2/ADAMTS13, vWF-A3-胶原抗血栓药物：抗GPIb/IX/VvWF胶原轴；抗GP/21胶原轴制剂；,Exposed collagen,platelet,血小板胶原受体,高剪切力条件下血小板初期不
2、稳定粘附依赖 GPIb/IX/V复合物和GP的协同作用 黏附后的血小板活化由GP介导 血小板牢固粘附则依赖GPIa/IIa和GPIIb/IIIa的共同作用 活化的血小板释放ADP、 TXA2，进一步加强 血小板粘附和聚集,血小板的黏附过程,Primary Platelet Adhesion Receptors,有关血小板胶原受体在血小板黏附及活化过程中的相对作用一直存在争议。最近发现GPIb/IX/V与GP可发生免疫共沉淀，结合两者有相似的信号转导途径，故有人提出GPIb/IX/V与GP在血小板膜上相互彼邻，在功能上相互协同。,GPVI缺乏患者的血小板聚集和释放反应图,Moroi M等1989
3、年报导一名GPVI缺乏患者有出血倾向，而胶原（2ug/ml)诱导的血小板聚集为3%（正常对照：50-75%）ATP不释放。ADP和瑞斯托霉素诱导的血小板聚集和释放正常。,Moroi M, et al . J Clin Invest, 1989;84:1440,Aggregation of platelets from 2 deficient mice in response to soluble collagen. Integrin 2-deficient mice develop normally, are fertile, and display no obvious anatomical
4、 defectsHomozygous 2-deficient mice are viable and show no striking phenotypical differencewhen compared with their heterozygous and wild type littermates.,Holtkotter O,et al.J Biol Chem, 2002:277:10789,抗血小板药物,药物 作用环节,第一代 阿司匹林 环氧酶抑制剂 临床应用Ticlopidine ADP活化抑制剂 临床应用 第二代 Reopro GPIIb-IIIa受体抑制剂 临床应用 第三代
5、JAQ1 GPVI（胶原）受体抑制剂 动物实验AjvW2, 6B4 “vWF-GPIb”抑制剂 动物实验82D6A3 “vWF-胶原” 抑制剂 动物实验,抗GP/21胶原轴制剂,抗GPIa/IIa抗体：15D7和6F1体外实验表面可抑制胶原诱导的血小板聚集；抑制高剪切力条件下血小板与固定的纤维状胶原表面的黏附抗GP单克隆抗体： JAQ1 9O12、6B12、11A12、SZ118等体外实验中，JAQ1完全抑制胶原诱导的血小板聚集，对凝血酶和佛波酯诱导的聚集无影响。体内实验中，JAQ1抑制胶原诱导的血小板聚集和促凝活性表达。肺栓塞模型中，95%对照小鼠在栓塞诱发后5分钟内死亡，而经JAQ1处理小
6、鼠均存活。使用JAQ1后出血的副作用轻。,血小板与胶原表面的有效黏附是血栓形成的必备条件之一，因而GPIb/IX/V-vWF-胶原轴和GP/21-胶原轴为抗血小板粘附治疗的主要靶点。,抗黏附治疗作用策略：,15D7,11A12,SZ118,抗GPIb/IX/VvWF胶原轴,抗GPIb单克隆抗体: 6B4 (SZ2)在狒狒的Folts模型中，6B4 Fab片断2 mgkg1注射。GPIb封闭率 69%；股动脉CFR抑制率100%；瑞斯托霉素诱导的血小板聚集抑制率100%；血小板数、出血时间无明显变化，PT、APTT正常。,Folts 模型,Reopro对CFRs发生的影响,2.5ug/ml Re
7、opro,0.0 3.0 6.0 0.0 2.5,813-F(ab)2,Reopro,0.0 3.0 6.0 0.0 2.5,813-F(ab)2 Reopro,*,*,*,*,0.01P0.05,*,抗vWF A1区单抗AJW200 在狗冠状动脉Folts实验模型中，AJW200 0.3mgkg1，冠状动脉内血栓形成抑制率达96，体外血小板聚集抑制率81%；血小板数无明显变化，但出血时间有延长（522分）。,Bar graph showing inhibitory effect of AJvW-2 on neointima formation 14 days after balloon in
8、jury. AJvW-2 was administered as a single bolus injection at doses of 0.6 mg/kg (n=11) and 1.8 mg/kg (n=10). *P0.01 vs control (n=11).,Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20:2303-2308.,AJvW-2 抗血管内膜增殖效应,活化血小板可释放出多种活性物质如PDGF、PAF、CD40L、MIP-1和P选择素等，介导血管损伤部为的炎性反应，出现炎性细胞迁移、平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖，促进动脉粥样斑块的发展。抗vWF A
9、1区单抗AJvW-2 可使受损的豚鼠颈动脉血管内膜/中层比下降65%，对血小板数、出血时间、PT、APTT无影响。以上结果表明抑制血小板粘附可减少血小板活化及血小板来源的细胞因子释放，减轻炎性反应和细胞增殖，有助于延缓动脉内膜病变。,抗vWF A1区单抗AJW200 AJW200人体实验（24例），AJW200 0.05 mgkg1，血浆vWF封闭率为62.4；vWF：Rcof活性为3416（对照11641）；PFA-100血流停止时间为20278秒（对照 8019秒）；所有志愿者出血时间和vWF抗原水平均无显著变化。,抗GPIb/IX/VvWF胶原轴,抗GPIb单克隆抗体: 6B4在狒狒的F
10、olts模型中，6B4 Fab片断2 mgkg1注射。GPIb封闭率 69%；股动脉CFR抑制率100%；瑞斯托霉素诱导的血小板聚集抑制率100%；血小板数、出血时间无明显变化，PT、APTT正常。VWF A3区单克隆抗体 82D6A3：在狒狒动脉血栓形成实验中，82D6A3 0.3 mgkg1可完全抑制股动脉血管内血栓形成， vWF与胶原结合能力抑制96；实验动物的血小板数、凝血指标、VWF水平和出血时间均无明显改变。,抗血小板粘附药物的优点,在动脉内高剪切力条件下，血小板有效粘附和血栓形成必需依赖胶原-vWF-GPIb轴，对此途径的抑制可更为特异地防止动脉内的血栓形成，而对静脉系统的影响小
11、，出血副作用轻。 血小板粘附后的信号转导和血小板活化则主要依赖胶原-GPVI轴，对此途径的抑制即可在更早阶段阻止血小板活化，进而抑制血栓形成。 在较早阶段抑制了血小板与病变部位的粘附及血小板活化，可明显减少血小板释放CD40, PDGF等细胞因子，能显著减轻血管炎性反应和细胞增殖，有助于延缓动脉内膜病变，减少再梗死的发生。,二、血栓性血小板减少性紫癜(TTP),五联征：发热、血小板减少性紫癜、微血管性溶血性 贫血、中枢神经系统异常、肾脏受累 发病机制：vWF-cp质或量异常(vWF-cp基因变异、抗 vWF-cp自身抗体)血管内皮损伤（抗内皮细胞自身抗体、细胞毒素）血小板活化凝血酶敏感蛋白1,
12、ADAMTS-13 缺乏相关性TTP发病机制模式图,Tsp1 repeat,vWF-cp结构模式图,vWF-cp结构图及基因突变位点：,* 我所发现的新突变位点,*,临床表现：见于任何年龄，大多数在1550岁；女性多见。出血：以皮肤粘膜出血为主，严重者可发生颅内出血。微血管病性溶血性贫血：黄疸，血红蛋白尿。神经精神症状：意识紊乱、头痛、失语、惊厥、视力障碍、谵妄及偏瘫等；以一过性，反复性和多变性为特征。 肾脏损害：蛋白尿、血尿、肌酐升高，肾功能衰竭。 发热：热型不一，体温常达3840.5。,血常规、血管内溶血相关检查vWF多聚体分析vWF-cp活性测定vWF-cp抗原测定vWF-cp自身抗体测
13、定vWF-cp基因突变检查ADAMTS-13/FXI Complex ELISA,实验室检查,vWF多聚体分析,SDS-PAGE加免疫印迹（Furlan方法） 双向免疫辐射计（Obert方法） 残余胶原结合试验（Gerristsen方法） 残余瑞斯脱霉素辅因子活性试验(Bohm方法） 特异性微小重组底物（GST-VWF73-H）用于vWF-cp活性检测,vWF-cp活性测定,ADAMTS13 抗原测定（ELISA）,ADAMTS13 自身抗体测定（ ELISA）,治疗：诊断明确或高度怀疑本病时应尽早开始治疗。1，血浆置换及输注新鲜血浆仍是目前最有效方法，6090病例有效，血浆置换量每天23升（
14、20ml30ml/Kg），严重者可增加至40ml80ml/Kg。病情稳定后继续12周。2，免疫抑制剂长春新碱每周12mg46周；或泼尼松1mg/kg，酌情增减。3，抗血小板GPIIb/IIIa单抗可阻断血小板聚集，4，抗CD20抗体、免疫球蛋白、切脾对难治、复发 或存在自身抗体的TTP有效。,三、血小板血栓形成调控因素,黏附、活化后的血小板从血流中募集/聚集血小板，形成稳定的血小板血栓。除已知的调控因素外，目前发现有多种新的调控途径参与血小板血栓的稳定过程。,Brass L. ATVB 2004;24:989-991,Gas6的结构及作用,Gas6 ( growth arrest-specif
15、ic 6 )是一种维生素K依赖蛋白，结构类似蛋白S，分子量75kDa，存在于静息血小板的颗粒中。血小板活化后，Gas6被释放至血小板表面和液相介质中。体内和体外实验均证明Gas6具有促进血小板活化作用，Gas6基因剔除或抗体抑制均可抑制血小板聚集及血栓形成。Gas6受体为血小板膜表面蛋白Mer（Ax1,Tyro3)，两者结合后，通过蛋白磷酸化途径（涉及PI-3K）活化血小板。根据Gas6-Mer作用特点，其功能发挥主要在血栓形成后期，对血栓形成有促进和稳定作用。,Gas6受体knockout对血小板聚集功能的影响,Gas6受体knockout对血小板伸展功能的影响,Gas6受体knockout
16、对血栓形成功能的影响,TOPICS1. Blood Coagulation Mechanisms 2. Platelet Physiology and Immunology 3. Bleeding Disorders 4. Venous Thromboembolism (Management of DVT, DVT in Asia and Western Countries) 5. Atherothrombosis in Asia: Aspects Different from Western World 6. Update on Anti-Platelet Therapy 7. New Developments on Antithrombotic Drugs 8. Chinese Herbal Medicine in Anti-Thrombotic Therapy 9. Cancer and Thrombosis 10. DIC in Asian Countries 11. Vascular Inflammation and Hemostasis Abnormalities 12. Prevention and Treatmeat of Celebro-Cardiovascular Diseases in Asian Countries,Thank you,
