1、第二章 中药化学成分的 一般研究方法, 21 中药化学成分类型简介,一、糖类单糖、低聚糖、多糖大多属于水溶性成分。 二、苷类糖和非糖物质通过糖的端基C原子链接而成的化合物。苷 苷元,苷多亲水 苷元偏亲脂,三、醌类分子中具有醌式结构的化合物萘醌类分子含酚羟基，有一定酸性，可溶于碱水。 四、苯丙素类含有C6C3骨架的化合物1、香豆素：邻羟基桂皮酸形成的酯，分子多含酚羟基。偏亲水性,2、木脂素：具有2个C6C3骨架的衍生物五、黄酮具有C6C3 C6骨架的衍生物异牡荆素多含酚羟基，显酸性，可溶于碱水。,六、萜和挥发油分子式符合（C5H8）n通式的化合物。薄荷醇 龙脑挥发油有挥发性，可随水蒸汽蒸馏。 七
2、、生物碱含N有机化合物，有碱性。龙胆碱 可溶于酸水,八、甾体类化合物含甾体母核的化合物。九、三萜化合物基本骨架由30个C组成。,十、鞣质复杂的多元酚类化合物总称。没食子酸 逆没食子酸属于水溶性成分。, 22各类中药化学成分的主要的生物合成途径,类型分类 C2单位（CH3COOH）：脂肪酸、酚酸、苯醌、等聚酮类 C5单位（异戊二烯）：萜类、甾类 C6单位 ：香豆素、木脂素等苯丙素类化合物 氨基酸：如生物碱类 复合单位：由上述单位复合构成,（一）醋酸 丙二酸途径 （AAMA途径）,产物：脂肪酸、酚类、蒽醌等1、脂肪酸 饱和脂肪酸AAMA途径 (乙酰丙二酸酯途径：缩合 、还原 )不饱和脂肪酸 氧化成
3、羟基衍生物 （ 脱水而成 ） （注：ATP：三磷酸腺苷 ADP：二磷酸腺苷）,2、酚类 AAMA途径：只有缩合,3、醌类 在 AAMA途径中由多酮环合成各种醌类和聚酮类,（二）甲戊二羟酸途径（ MVA）,产物 萜类、甾体类 MVA 头尾 DMP（焦磷酸二甲烯丙酯） IPP (焦磷酸异戊烯酯) 氧化、还原、脱羧、缩合、重排 反式角鲨烯 三萜、甾类,（三）莽草酸途径（桂皮酸途径 ）,产物 具有C6-C3 骨架的苯丙素衍生物：香豆素、木质素、木脂素等具有 C6-C3-C6 骨架的衍生物：黄酮类 前体 苯丙氨酸,（四）氨基酸途径 （aa途径）,产物 生物碱 前体 乌氨酸 、赖氨酸脂肪胺 （TCA循环中
4、酮酸还原氨） 苯丙氨酸、酪氨酸 、色氨酸 芳香族生物碱（莽草酸途径）,（五）复合途径,1、AAMA途径 莽草酸途径 2、AAMA途径 MVA途径 3、aa MVA途径 4、aa AAMA途径 5、aa 莽草酸途径, 22 提 取 分 离 方 法 一、中药有效成分的提取方法,提取法,溶剂法 相似相溶原理（重点）水蒸气蒸馏法 适于挥发性成分超临界流体萃取法 适于多种物质,（一） 溶剂法,1、溶剂类型,水亲水性溶剂MeOH EtOH Me2CO中等极性溶剂 n-BuOH EtOAC亲脂性溶剂 Et2O petCHCL3 C6H6,相似相溶原理,相似极性相溶，其溶解性与分子极性有关。非极性分子所有饱和
5、烷烃。R 极性分子含有以下官能团的化合物都有极性： OH COOH NH2 CO CHO COOR X （F CL Br I） OCH3 CC,溶剂极性强弱排列顺序,Pet CCL4 C6H6 CH2CL2 CHCL3 Et2O EtOAc n-BuOH Me2CO MeOH（ EtOH） H2O 石油醚 四氯化碳 苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 正丁醇 丙酮 甲醇（乙醇） 水,3 提取范围,pet 油脂、蜡、叶绿素、游离甾体及三萜类 CHCL3 EtOAC 游离生物碱、有机酸、黄酮和 香豆素苷元 MeOH EtOH Me2CO 苷类、生物碱盐、及鞣质类 水 氨基酸、糖类（黏液质、果胶）无
6、机盐等,3 常用提取方法,（1）浸渍法 适于对热不稳定成分 （提取率不高） （2）渗滤法 优于（1）法，但溶剂用量大 （3）煎煮法 水提 ，不适于对热不稳定的成分及挥发油成分 （4）回流提取法 适于用有机溶剂提取 （5）连续回流提取法 用索氏提取器提，溶剂用量少，提取率高,（二）水蒸汽蒸馏法此法适于挥发性成分的提取。 （三）超临界流体萃取法（SFE） 是一种集提取与分离于一体，又基本上不用有机溶剂的新技术。 超临界流体是一种处于临界温度和临界压力以上，介于气体和液体之间的流体，具有很强的溶解能力，适于对很多物质的提取。,（三）超临界流体萃取仪,二、中药有效成分的分离与精制,（一）溶剂法 1、酸
7、溶碱沉法 碱溶酸沉法 酸溶碱沉法 提取生物碱 碱溶酸沉法 提取酚酸性成分：黄酮、蒽醌等 原理 离子态溶解，分子态难溶而沉淀析出,2、溶剂分配法 （萃取法） 原理 利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数（K）的不同而达到分离的方法。Cu （有机溶剂）上相KD = CL (水层) 下相,萃取仪器分液漏斗,2、萃取操作注意问题,必须是互不相容的两相溶剂注意温度浓度对KD值的影响 注意事项 防止乳化破乳方法 抽滤，加热， 冷冻长时间放置加入破乳剂,3、可进行两相溶剂萃取的组合,水石油醚 水苯 水乙醚 水己烷 水氯仿 水乙酸乙酯 水正丁醇不可进行萃取的溶剂组合 水乙醇 水甲醇 水丙酮 乙醇氯仿
8、 甲醇乙酸乙酯,2、沉淀法 （1 ）溶剂沉淀法,原理 改变混合溶剂极性使一部分成分沉淀 分类 : 1.水提醇沉法 去除多糖、蛋白质等 水溶性杂质 2.醇提水沉法 除去树脂、叶绿素等亲脂性杂质 3.醇提醚（丙酮）沉淀法 可沉淀皂苷,（2） 金属盐沉淀法,酸性物 可用 Ca+ Ba+ Pb+等沉淀 碱性物 苦味酸盐沉淀 雷氏铵盐沉淀中性 Pb(AC)2 可沉淀COOH， 邻二酚羟基 Pb+ 碱性 Pb(OH)AC ( 除以上可沉 淀 外)再加使单酚羟基或多元醇沉淀,3、结晶、重结晶法 原理 利用温度不同引起溶解度 的改变进行分离,（1） 溶剂选择,对纯化成分 热溶，冷不溶 对杂质 冷热都不溶或冷热
9、都溶 沸点不可太高，易于回收（n-BuOH不适合b.p太高） 对纯化成分不反应,（2）结晶纯度的检查,1、外观：颜色、晶型 完全一致2、mp： 检查溶点、溶距 （不超过1）3、TLC 三种不同溶剂系统均为一个 斑点,（3）结晶制备,去杂 制备过饱和溶液 析晶 操作关键：溶解 趁热抽滤沉淀 （热不溶的杂质）滤液 放冷析晶 （冷热都溶杂质）母液 结晶,4 、其他方法,（1）分馏法利用被分离物各成分沸点的不同进行分离。 （2）膜分离法小分子可通过生物膜，大分子通不过，适于多糖、肽及蛋白质大分子的精制。 （3）升华法适于有升华性的成分的分离。,（三）色谱分离法,1、定义利用混合物中各成分对固定相和移动
10、相的亲和力的差异使之相互分离的方法，又称层析法或色层法。这是一种物理化学分离、分析技术。 2、作用可用于混合物的分离，又可用于化合物的定性检识和定量分析。,一色谱法分类,【1】按分离原理分：1、 极性吸附色谱法2、 分配色谱法3、 聚酰胺色谱法4、 大孔树脂色谱法5、 凝胶色谱法6、 离子交换树脂色谱法,【2】按操作方法分 1、柱层析用于样品分离、精制 2、薄层层析（TLC）定性、定量 3、纸色谱（ PC） 定性、定量 【3】按两相状态分 1、液固色谱 2、液液色谱 3、气固色谱 4、气液色谱,【一】吸附色谱,极性吸附剂硅胶，氧化铝 1、 分类 非极性吸附剂活性炭2、吸附规律总原则为相似者易于
11、吸附极性吸附层析极性强者易吸附非极性吸附层析对非极性物质吸附牢,极性层析法分离规律,1）吸附规律被分离物极性越强，吸附越牢，极性越弱，吸附越弱。 2）分离规律:TLC: 极性强的吸附牢，展开距离短，Rf值小极性弱的吸附弱，展开距离长，Rf值大 柱层析 : 极性强的吸附牢，洗脱速度慢，后洗下极性弱的吸附弱，洗脱速度快，先洗下,3、极性强弱的判断,（1）极性的概念表示分子中电荷不对称程度分子偶极矩越大者，极性越强相关因素 分子极化度越强者，极性越强介电常数越大，极性越强（2）常见有机官能团极性顺序: -CH2- CH2- (-R) -CH2=CH2 OCH3 -COOR C=O (CHO) -NH
12、2 -OH - COOH,(3)常见有机溶剂极性顺序与 己烷（1.88） C6H6（2.29） Et2O （无水4.47） CHCL3（5.20） EtOAc（6.11） n-BuOH （ 17.5 ) Me2CO ( 20.7） EtOH （26.0） MeOH （31.2）H2O （81.0）,(4)比较原则 a）官能团种类母核相同按官能团极性顺序排列 b）官能团数目极性官能团多者，分子极性强c）官能团排列易形成分子内氢键者 和有空间位阻者,极性官能团的极性下降。 d）母核不同，按C / O、N 比值判断，比值高者，极性小，比值小者，极性大。（经验法）,硅胶、氧化铝与活性炭吸附规律的差异,
13、1、硅胶、氧化铝对极性物质吸附牢活性炭相反对非极性物质吸附牢。（但对于芳 香族吸附大于脂肪族） 2、同系物：硅胶、氧化铝 分子量小的吸附牢活性炭 分子量大的吸附牢 3、溶剂介质影响：硅胶、氧化铝在水中活性下降活性炭在水中吸附性提高,G H,E F,排列以上化合物的极性顺序,1、 A、B、C、D 极性：A B C D 2、 E、F、G、H 极性：G H F E 3、 A、B、C、D、E、F、G、H 极性：GAHBFECD,排列以上化合物在硅胶G板的Rf 展开剂pet：EtOAc（10：1）,1、Rf： D C B A2、Rf： E F H G3、Rf：D C E F B H A G,氧化铝，硅胶
14、分离极性小的亲 3分离对象 脂性成分。（应用广）活性炭分离极性大的亲水性成分,柱 层 析 色 谱 分 离 法,吸附柱层析法,【二】液液分配柱色谱法,(1 ) 正相分配色谱固定相极性 流动相 分类 反相分配色谱固定相极性 流动相正相分 固定相 （液） 水 配柱色 流动相 （液） 水饱和有机溶剂谱 支持剂载体,（2）常用载体纤维素、 硅藻土 硅胶（含水10） （3）分离对象亲水性，或水溶性成分，如：苷类，糖类，生物碱类反相分配层析分离亲脂性成分硅胶表面亲油性表面（不同长度R 取代）,分离规律,正相分配色谱： 亲脂性成分易溶于流动相，吸附弱，Rf值大（柱层析先洗下）； 亲水性成分易溶于固定相，吸附牢
15、，Rf值小（柱层析后洗下） 反相分配色谱： 与以上结果相反,【三】聚酰胺吸附色谱法,（1）吸附原理形成分子间氢键n 聚酰胺 分离对象： （2）可形成氢键的官能团：Ar-OH， NH2， COOH，C=O ，（CHO）NO2,（3）吸附规律：,1 形成氢键基团数目越多，则吸附能力越强.2 已形成分子内氢键者吸附力减弱.3 分子芳香化程度越高者，吸附越牢4 糖一般不参与吸附5与溶剂介质有关.形成氢键能力 水中最强碱中最弱,水 MeOH Me2CO NaOH/H2O 甲酰胺二甲基甲酰胺 尿素/H2O,溶剂洗脱顺序：,【四】大孔树脂 色谱法,吸附原理吸附性分子筛吸附性范德华引力分子筛分子量大小分离对象
16、苷、糖类(多糖)、黄酮三萜等分离收集,【五】凝胶色谱法,1.原理根据物质分子大小差别进行分离， 利用分子筛分离物质进行分离( 又名:分子筛过滤、排阻色谱) 洗脱规律 分子量大的先洗下分子量小的后洗下,凝胶色谱示意图,【六】离子交换色谱法,1、分离对象酸性、碱性化合物分离 2.分类 阳离子交换树脂 SO3H阴离子交换树脂 N(CH3)3 3、吸附规律离子化程度高者吸附牢阳离子树脂碱性强者吸附牢阴离子树脂酸性强者吸附牢,色谱分离法小结,一、分类 吸附层析吸附能力不同 1、按原理分 分配层析分离系数不同凝胶层析分子大小不同离子交换层析分子解离程度不同柱层析LSC 2、按操作分 薄层层析TLC纸层析P
17、C,二、吸附规律 硅胶 AL2O3极性大着吸附牢1、吸附层析 活性炭极性弱着吸附牢聚酰胺易形成分子间氢键的吸附牢正相 亲水性强着吸附牢Rf小 2、分配层析层析 亲脂性强者吸附弱Rf大反相层析 与上相反,阴离子交换树脂酸性越强吸附越强，反之吸附越弱,4、离子交换 阳离子交换树脂碱性越强吸附越牢， 反之吸附越弱,3、凝胶层析 分子量小的吸附牢，分子量大 的位阻 小，吸附弱，分子量大的先洗下，分子 量小的后下,三、分离对象吸附层析分离亲脂性成分如：游离生物碱、甾类和三萜等。分配层析分离极性大的成分如各类苷类聚酰胺层析 分离香豆素、黄酮、蒽醌类含酚羟基的成分离子交换树脂 分离生物碱和酸性成分凝胶层析
18、分离分子量差别大的成分,其它色谱法,1、气相色谱法GC气体作移动相 2、高效液相色谱法HPLC 3、真空液相色谱法 4、高效薄层色谱法 HPTLC 5、高速逆流色谱法 6、离心薄层色谱法,THE END,24 中药化学成分的检识方法,一、理化检识 1、沉淀反应2、显色反应 二、色谱检识： （对照品、Rf、显色） 1、薄层色谱法（TLC） 2、纸色谱法（PC） 3、气相色谱（GC）和高效液相色谱法（HPLC）,14 结构研究法,一、结构研究的主要程序：1、确定化合物纯度 mp TLC PC HPLC法2、测定分子量 MS法：M3、确定分子式 元素分析法定性、定量分析 高分辨MS法（HRMS）分子
19、量可精确到小数点后3位数,4、计算分子不饱和度 I / 2 III / 2 1 I 1价原子 （H、D、X）的数目 3价原子（N、P等）的数目 4价原子（C、S）的数目 （O、S为二价原子，与不饱和度无关，不考虑）,二、光谱测定和解析 （MS、IR、UV、NMR）,一、不同电磁波的波谱分类 1、X-射线衍射内层电子能级跃迁：X-衍射 2、紫外可见光谱外层电子能级跃迁：紫外 3、红外光谱分子振动与转动能级跃迁：红外 4、微波吸收谱电子自旋能级跃迁：微波 5、核磁共振谱核自旋能级跃迁：无线电波,二、主要电磁波的不同区域,近紫外区200nm400nm 紫外可见光谱 可见光区400nm800nm 中红
20、外区2.525m（4000400cm1） 核磁共振光谱区0.6m300m,（一）、MS（质谱） 1、MS图谱的表示方法,m/z（碎片峰） 推测分子结构,2、作用 M（分子离子峰） 确定分子量,3、分类 EIMS（电子轰击） 适于M稳定的化合物FDMS（场解吸） 适于难挥发，对热不稳 定化合物，如肽 FABMS（快速原子轰击） 适于高分子、对热不稳定、和强极性化合物如：肽、糖、苷、抗生素、维生素等CIMS（化学电离） 可解析碎片峰少,（二）IR（红外光谱）鉴定分子各官能团,1、IR光谱图示：,infrared spectrum,分子价键 V （伸缩） 在4000625cm1 测得图谱 1、特征频
21、率区（40001500cm1） 1VOH （32003700 cm1） 游离OH： 37003500 cm1缔合OH： 34503200 cm1VNH （35003300 cm1）（弱）,2VCH （30002700 cm1） VCH3： 29602870 cm1VC CH：3300 cm1 3 Vcc ： 24002100 cm14VCO （19001650 cm1） 17051725 cm1 17401725 cm1,2、指纹区特征 1500650 cm1,（因各分子指纹区不同，IR光谱可代表分子整体结构） 1VCCH RCHCH2 990 910 强RCHCHR （顺） 690 中强RC
22、HCHR （反） 970 中强RCCH2（末端） 870 中强,2V Ar-H 单取代（5邻氢） 700 770 强 邻位取代（4邻氢） 700735 强 间位取代（3邻氢） 810750 强 对位取代（2邻氢） 860800 强,三、UV可见吸收光谱 （200700nm）,1、鉴定分子中不饱和双键和共轭双键的结构（不代表分子整体结构） R（饱和烃） * (无紫外吸收) CHCH（不饱和烃）* (有紫外吸收) PhOH（含杂原子） n * （有紫外可见光吸收）,芳香族化合物香豆素、蒽醌、黄酮等可用UV光谱推测分子结构及取代基类型和数目。 2、UV光谱表示方法：,ultraviolet spec
23、tra,（四）NMR（核磁共振谱）,化学位移 V样 V标（Hz）(ppm) V仪（MHz）化学位移为相对标量，不随测试仪器改变 有机化合物：多数在 0 13 ppm TMS (tetramethylsilane)作内标 = 0 ppm (屏蔽作用很大)。 只有一个信号(单峰)。 易挥发除去，化学性质稳定。,去屏蔽效应 屏蔽效应大 向低磁场移 小 向高磁场移 H 19 ppm 0 ppmC 200ppm 0 ppm,1HNMR（氢谱）,1、1HNMR（氢谱）提供分子中H的数目、类型及化学环境。 11HNMR光谱图示：,CH3CH2OHa b C （ 乙 醇 的 氢 谱 图,不同氢核的大致范围,C
24、H3 0.81.2 CH2 12.5 CH 2.53.5 CH 58 C CH 23 芳环及芳杂环 69 CHO 910COOH 1011活泼H（OH、SH、NH） 不定，加D2O后消失,不同氢核的相对位置,影响因素不同 而不同,1、诱导、共轭 2、各相异性 3、 氢键、原子快速交换 （1）诱导效应 M （推电基）使电子云密度加大，变小，向高场移 I（吸电基）使电子云密度减少，加大，向低场移,推电基R（烷烃基） 吸电基不饱和双键和含杂原子的基团 如电负性 O N C 所以：OCH3 NCH3 CH3 （2）共轭效应 使电子云密度加大者，变小； 使电子云密度减少者，加大 苯酚的p共轭使邻对位电子
25、云密度加大，减小其间位的电子云密度减少，加大,（2）各向异性由于电子云密度排布原因使相邻质子,某些位置处在屏蔽区（）， 电子云密度加大，小（高场）某些位置处在负屏蔽区（），电子云密度减少，大（低场）,（4）氢键使H质子向低场位移，加大 （5）质子快速交换反应的影响OH SH NH2 COOH CHO 为活泼氢，不固定，受浓度、温度、溶剂影响而变化，加D2O后消失,（二）偶合常数 J （Hz）,（1）偶合常数的表示： 单峰 S 双峰 d 三峰 t 四峰 q 多重峰 m 2个双峰 dd,（2）各类偶合常数：,苯 环 J邻（O）610 Hz J 间（m)3 Hz J 对（p） 01 Hz (一般不考
26、虑）,脂环烃,Jae26 Hz Jaa813Hz Jee28Hz烯烃 J 反（trans）1218Hz J 顺（cis）612Hz,（三）氢谱解析,峰位值 确定H的归属峰面积（积分曲线、积分值） 确定H的数目峰形（J、信号裂分数）确定H之间的相邻关系,2、13CNMR（碳谱）,（1）ppm 0250 偶合常数1JCH ：120320 Hz （2）碳谱解析： 1 全去偶谱 可获知C的数目和C的不同化学环境,2偏共振去偶谱：,只保留了C和H之间的偶合，所以峰形的裂分数可以推测C的类型 季碳 S 峰 叔碳 d峰 仲碳 t 峰 伯碳 q峰,（3）常见官能团的C的ppm值：,1 sp3 C20100 sp2 C 100200 sp C70130 2sp3 CH3 19.8 CH225 OCH35069,3sp2 ,CC 100120 Ar 100135 ArC 135150ArO 148199 CO 187202,DEPT 13C NMR,一种特殊技术，可识别碳的类型 （CH3, CH2, CH, and C) 可确定与碳相连的质子的数目以及各类碳的数目,二维核磁共振谱,1H-1H COSY,THE END,
