1、第七章 外源化学物致突变作用,概要,第一节 概述基本概念第二节 外源化学物致突变的类型第三节 外源化学物致突变作用机制 及后果第四节 机体对致突变作用的影响第五节 观察化学毒物致突变作用的基本方法,目的要求,掌握化学物致突变作用的基本概念、类型及后果。 熟悉评价化学物致突变作用的常用方法及使用范围。 了解影响化学物致突变作用的因素及评价致突变作用原则。,第一节 概述 一、突变作用的研究史,摩尔根（18661945），美国著名遗传学家，现代遗传学奠基人之一，提出了遗传学三条基本定律中的基因连锁互换定律，确立了基因作为遗传单位的基本概念，并因此而获得1933年诺贝尔生理学和医学奖。,斯特蒂文特 卡
2、尔文布里奇斯赫尔曼约瑟夫穆勒,个性独特的三驾马车,突变作用的研究史,美国遗传学家。19111916年间，马勒是摩尔根果蝇小组的一个重要成员，他的主要工作是研究果蝇的遗传交换这是染色体遗传学说的重要基础，其内容已概括在果蝇小组成员合写的孟德尔式遗传的机制(1923)一书中。1927年，他发现了 X射线的诱变作用。这项研究结果不但有助于研究基因的本质和基因如何控制代谢作用及个体发育，有利于通过突变基因进行染色体结构分析研究，而且在诱变育种发展农业生产方面也有重要意义。,Hermann Joseph Muller (18901967) 1946年获诺贝尔 生理学医学奖。,20世纪50年代，Watso
3、n 和Crick阐明了DNA的结构，为研究突变机理开辟了一条新的途径。 根据Franklin的新X光照片,Watson和Crick提出了双螺旋结构的设想,并将核糖核酸和磷酸组成的骨架放在分子的外面1962年获诺贝尔生理学医学奖。,Rosalind Franklin,突变作用的研究史,1969年，Hollaender主持下在美国成立了环境诱变剂协会(Environmental mutagen society,EMS)。 遗传毒理学形成为独立学科。 国际癌症研究中心(IARC)证明人类癌症约有90%与化学物(包括药物)有关，并明确指出致癌剂中90%也是致突变剂。 Ames方法的建立和应用，在环境致
4、突变物和致癌物的筛选方面取得了很大进展。,二、基本概念 变异（Variation）生物体亲代与子代间或子代个体间不同程度的差异。产生原因：基因重组、基因突变、染色体成分改变、细胞质变化。突变（Mutation）遗传物质自身发生改变及其引起的变异。分为自发突变和诱发突变,遗传毒理学 (genetic toxicology)属毒理学下属三级学科,是研究化学性和放射性物质对机体遗传物质的损害作用（致突变作用）及可能引起的健康效应。致突变作用 (Mutagenesis)外来因素（化学物）引起细胞核中遗传物质发生改变的能力，且此种改变可随细胞分裂过程而传递。,遗传毒性 (genetic toxicity
5、)指对基因组的损害能力，包括对基因组的毒作用引起的致突变性及其他各种不同效应。致突变性 (Mutagenicity)是精确的概念，指引起遗传物质发生突变的能力，在一个实验群体中突变率可以定量检测。二者既有联系又有区别,三、遗传学基础 DNA与基因 A gene is defined biochemically as a segment of DNA (or,in a few cases, RNA) that encodes the information required to produce a functional biological product. From .L .Nelson,
6、M.M.Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 2. 染色质与染色体染色质：在间期细胞的细胞核中，由DNA、组蛋白及少量的RNA组成。染色体：在细胞分裂时，染色质螺旋化形成。,思考：染色体与基因的关系？ 3. 体细胞与生殖细胞体细胞：多是二倍体细胞，含有两组完全相同的染色体，其遗传损伤不会遗传给下一代。生殖细胞：是单倍体，其染色体改变及突变可传给下一代。 4. 基因型与表型5. 细胞周期、有丝分裂与减数分裂,第二节 外源化学物致突变的类型,遗传毒理学家主要关注三类遗传学损伤：基因突变，染色体畸变，染色体数目改变损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA
7、以外的靶组织受损。三类损伤的本质是相同的，区别在于受损程度。通常以光学显微镜的分辨率0.2m来区分。,一、基因突变（gene mutation）基因中DNA序列的改变。也称为点突变（point mutation） 分类 按突变发生的原因：自发和诱发 按基因结构改变类型：碱基置换和移码突变 按突变的生物学意义：同义、错义、无义。,碱基置换 (basepair substitution)指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。 转换 (transition)嘌呤互相取代；嘧啶互相取代。 颠换 (transversion)嘌呤取代嘧啶；嘧啶取代嘌呤。 对生物损害的后果取决于其在蛋白质合成过程中错义和
8、无义密码的多少。同义突变 移码突变 (frameshift mutation) 指发生一对或几对（3对除外）的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。,基因突变的特点： 1 是具有一定发生概率的偶发事件； 2 其发生率可受内外环境影响； 3 具有可逆性； 4 具有可遗传性。,二、染色体畸变（chromosome aberration）指染色体结构改变，它是指遗传物质大的改变。一般可用光学显微镜检查适当有丝分裂中期的染色体来发现。分染色单体型畸变和染色体型畸变。结构异常:缺失 (deletion)重复 (duplication)倒位 (inve
9、rsion)易位 (translocation),染色体插入和重复示意图,染色体缺失及环状染色体的形成图,染色体的臂间倒位,染色体相互易位示意图,三、非整倍体和多倍体 (aneuploidy and polyloid) 细胞的染色体数目不同于正常的染色体数目。或称为基因组突变（genomic mutation) 即基因组中染色体数目的改变 染色体数目异常以二倍体细胞为标准进行命名。 非整倍体指增加或减少一条或几条染色体； 多倍体指以染色体组为单位的增加。,人群出生发病率：1/7001/900。如小头，枕部扁平，项厚，眼裂小，外侧上斜，内眦深，眼距宽，马鞍鼻，口常半开，舌常口外，手指短粗，掌纹有
10、通贯，小指内弯等。50%合并先天性心脏病、消化道畸形、白血病等。,第三节 外源化学物致突变作用的机制与后果,直接作用于DNA 诱导基因突变和染色体畸变干扰有丝分裂 诱导非整倍体和多倍体非遗传物质损伤,(一) 碱基损伤 1. 碱基错配2. 平面大分子嵌入DNA链 （9-氨基丫叮） 3. 碱基类似物的取代碱基的化学结构改变或破坏（亚硝酸盐使腺嘌呤和胞嘧啶发生氧化脱氨、甲醛）,一、引起突变的DNA变化 遗传物质损伤,（二）DNA链受损 1. 二聚体的形成 当细胞或机体受到紫外线刺激。2. DNA加合物（DNA adducts）形成活性化学物与细胞大分子之间通过共价键 活化癌基因，影响调节癌基因和抑癌
11、基因的表达。 3. DNA-蛋白质交联物(DNA-Proteincrosslink，DPC)形成 是致突变物对生物大分子的一种重要的遗传损害。,与微管蛋白二聚体结合 秋水仙碱可与该部位结合，产生细胞染色体不分离。 与微管蛋白巯基结合 已组装好的微管的破坏1）与微管结合蛋白结合2）非特异性地作用与微管，使其蛋白质变性3）使微管失去定向能力 中心粒移动受阻,二、引起突变的细胞分裂过程的改变,DNA复制的高保真性 与DNA复制相关酶类的损伤； 修复 与DNA修复相关的酶受损。,三、其他的改变,四、突变的后果,(一) 生殖细胞突变,基因库（gene pool）某物种在特定时期中能将遗传信息传递给下一代
12、的处于生育年龄的群体所含基因总和。 遗传负荷（genetic load）是指在一种物种群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平。突变负荷：是指由于基因的致死突变或有害基因突变产生而降低了适合度，给群体带来的负荷。分离负荷：是指由于杂合子（Aa）和杂合子（Aa）之间的婚配，后代中必将分离而产生一部分适合度降低的纯合子（aa），因而导致群体的适合度降低。,后果有肿瘤、衰老、动脉粥样硬化及畸形等，最受关注的是肿瘤。 突变在癌发生过程中的中心作用的重要证据来自于癌基因和抑癌基因的分子生物学研究。,(二) 体细胞突变,第四节 机体对致突变作用的影响,遗传物质在所有物种中能世代相传的原因： 1
13、）DNA执行高度保真的复制，对复制中的错误能及时纠正，即通过修复而达到高度保真； 2）机体已进化有多种机制修复DNA损伤以保护亲代DNA链，使其免受化学毒物的作用而发生改变。机体修复DNA损伤的机制分为两大类： 损伤耐受机制和修复机制,一、DNA损伤的修复,1.直接修复 存在于多数生物体内，主要依赖酶作用。 1）光复活（光裂合酶） 2）“适应性” 反应鸟嘌呤O-6位被烷化，易造成碱基错配。将鸟嘌呤O-6位甲基转给O-6甲基鸟嘌呤-DNA甲基化转移酶，鸟嘌呤恢复正常。,2.切除修复 负责较大范围损伤的修复机制，它是一个多步骤的修复过程。是一种比较普遍的修复机制。 其过程是：切补切缝 由专一性核酸
14、内切酶催化，在离损伤处附近切断；由DNA聚合酶在断口处进行DNA合成；由5核酸外切酶将损伤部位切掉；由连接酶将新合成的DNA链与原来的链连接。切除修复有核苷酸切除修复和 碱基切除修复两种。,核苷酸切除修复,碱基切除修复,3. 错配修复 (mismatch repair)它可以识别并除去错配的碱基对。 4. 双链断裂修复是一种耐受过程。 5. 交联修复 1）无误交联修复 2）易误交联修复化学致突变作用的模式损伤-修复-突变,二、遗传因素对致突变作用的影响,个体因素影响致突变作用有两个方面，一是先天性，即遗传因素；二是后天性，不同生活方式。,(一)代谢酶遗传多态性 遗传多态性 (genetic p
15、olymorphism)是一个衡量遗传变异的数据，即群体中多态基因的比例。 氧化代谢酶 细胞色素P450酶 酯酶 环氧化物水解酶 谷胱甘肽硫转移酶 (GST),(二)修复能力的个体差异 修复酶的多态性 1. O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）是体内一种特异性修复酶。MGMT多态性可解释某些个体对烷化剂作用特别敏感的现象。 2. 聚（二磷酸腺苷-核糖）多聚酶（PARP）是另一类参与DNA断裂的修复酶。PARP的激活为DNA损伤后细胞的早期反应之一。,第五节 观察外源化学物致突变 作用的基本方法,一、观察项目的选择 遗传学终点（genetic endpoint）：遗传学实验观察到的现
16、象所反应的各种事件。 遗传学终点分类： 共4类 1）基因突变；2）染色体畸变；3）染色体组畸变；4）DNA损伤 遗传学实验配套原则：遗传学终点齐全；包括真核细胞和原核细胞；生殖细胞和体细胞俱在；体内实验和体外实验相结合，体外实验要有活化系统。,Definition: The Ames Test is named after its developer, microbiologist Bruce Ames. It is a test that measures a chemicals mutagenic strength in a bacterial cell.,（一）细菌回复突变试验,二、常见
17、致突变试验,基因工程,致突变物,常用的菌株有鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌（E.Coli) 目前，Ames试验作为检测环境诱变剂的一组试验中的首选试验，广泛应用于致突变化学物的初筛。,1 组氨酸缺陷 原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。 鉴定方法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸培养基平板和无组氨酸平板上划线，于37下培养24h后观察结果。 结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长。,2 脂多糖屏障缺损 原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质如结晶紫
18、能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。 鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，然后将浸湿的0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。37下培养24h后观察结果。 结果判断：假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带，说明该待测菌株具有rfa突变。,3 氨苄青霉素抗性 原理：含R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。因为R因子不太稳定，容易丢失，故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。 鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL，在氨苄青霉素平板上划线，37下培养24h后观察结果。 结果判断；假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长，说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用，表
19、示含R因子，否则，表示测试菌不含R因子或R因子丢失。,4 紫外线敏感性 原理：具有uvrB突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。 鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，用黑纸盖住平板的一半，置紫外灯下照射（15W，距离33cm）8秒钟。置37下孵育24h后观察结果。 结果判断：具有uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。,5 四环素抗性 原理：具有pAQI的菌株对四环素有抗性。 鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于氨苄青霉素/四环素平板上划线，置37下孵
20、育24h后观察结果。 结果判断：假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长，表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性，具有pAQI质粒，否则，说明测试菌株不含pAQI质粒。,菌株 检出突变 切除修复 R因子 脂多糖突变 TA1535 置换 uvrB 无 rfa TA100 置换移码 uvrB pKM101 rfa TA1537 移码 uvrB 无 rfa TA97 移码 uvrB pKM101 rfa TA98 移码 uvrB pKM101 rfa TA102 置换移码 存 在 pKM101 rfapAQ1,Ames试验常用配套菌株,分为：斑点试验和平板掺入试验,（二）微核试验（micr
21、onucleus test, MNT）与染色体损伤有关,微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环，比主核小。形成原因（1）受到染色体断裂剂作用（2）受到纺缍体毒物的作用,传统微核试验在骨髓嗜多染红细胞 (PCE)细胞中的微核,目前对微核试验已有较大的改进：1）体外微核试验2）外周血微核试验3）双核细胞法4）免疫荧光和荧光原位杂交法,（三）染色体畸变分析 (chromosome aberration analysis),主要观察染色体形态结构和数目异常。 直接观察 显带观察 流式细胞仪,染色体畸变分析用于观察染色体畸变和
22、染色体分离异常,（四）SCE试验(sister-chromatid exchange) 指染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换，其频率与DNA断裂和修复有关。用于检测DNA损伤。,（五）果蝇伴性隐性致死试验 （sex-linked recessive lethal, SLRL）,（六）显性致死试验（dominant lethal test）,检测生殖细胞遗传性损伤。 雄性染毒一个生精周期。致突变物可引起哺乳动物生殖细胞染色体畸变，以致不能与异性生殖细胞结合或导致受精卵在着床前死亡，或导致胚胎早期死亡。,雄性动物生殖细胞遗传毒性检测方法,精子发育 给药到精子成熟经历时间（周）阶段 小鼠 大鼠
23、 精原细胞 6 9 初级精母细胞 5 68 次级精母细胞 4 68 前期精细胞 3 45 后期精细胞 2 3 附睾和输精管内精子 1 12,（七）程序外DNA合成试验 （unscheduled DNA synthesis test）,正常情况下，DNA在细胞分裂的S期合成，当受到外来化学物干扰时，在S期以上也会出现DNA合成。 用3H-胸苷掺入培养细胞或受试动物。 放射自显影或液体闪烁计数法。,程序外DNA合成试验,Setlow 发现UDS 1970s 诱变检测 3H-TdR掺入,（八）正向突变试验,HGPRT基因突变试验次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT) 6-硫代鸟嘌呤 6-硫代鸟嘌
24、呤磷酸核糖 V79细胞株 TK基因突变试验胸苷激酶(TK)三氟胸苷 三氟胸苷酸 L5178Y+/-细胞株,它们的代谢产物可掺入DNA引起细胞死亡，因此正常细胞在含有这些碱基类似物的培养基中不能生长，在致突变物作用下此两个位点发生突变的细胞对这些碱基类似物具有抗药性，可以增殖成为克隆(细胞集落)。,（九）单细胞凝胶电泳试验（Single cell gel electrophoresis，SCGE）也称彗星试验（Comet assay）,1 基因突变检测 Ames试验、果蝇伴性隐性致死试验、正向基因突变试验 2 染色体损伤检测 染色体畸变分析、微核试验、显性致死试验 3 DNA损伤检测 SCE试验
25、、UDS试验、SCGE试验,彗星试验、染色体畸变或微核试验、正向突变试验检出的遗传损伤终点的差异,（十）观察方法的新进展 转基因动物致突变实验步骤（Procedure for transgenic rodent mutation assays）,Fluorescence in situ hybridization，FISH,在遗传毒理学中主要有以下两个方面的应用 染色体精细结构的分析；非整倍体的检测,Detection of aneuploidy,Flow cytometry: method to determine level of aneuploidy,DNA adduct： Adduct
26、 counts label with 32P,三、致突变试验中的一些问题,（一）阴性和阳性对照的设立对照是将实验组与非实验组的非处理因素处于相等状态，使判断结果可认为是有处理因素所致，从而抵消或减少实验误差。在遗传毒理学试验中均应设立阴性对照和阳性对照。1 阴性对照 是未处理对照，即不加任何 处理。目的是获得实验的基础数据。2 阳性对照 是用某种已知能产生阳性反应的物质为对照。目的是通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠性；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。,大鼠肝S-9经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心所得的上清液，加上适
27、当的缓冲液和辅助因子。主要含有混合功能氧化酶（MFO）。 肝原代细胞 纯化酶和基因工程酶,（二）体外试验的活化系统许多化合物本身不具有致突变性，必须通过代谢转变成致突变物。,（三）致突变试验与致癌试验的关系1）已知大多数化学致癌物具有致突变作用；2）发现人类接触的致癌物与DNA加合物、肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对之间具有相关性；3）传统的长期致癌试验，花费大。周期长，不能适应化学快速增长需要,（四）试验结果在毒理学安全评价中的应用致突变试验的质量控制：1） 设立阴性和阳性对照；2）盲法观察；3）资料的统计学分析；4）试验结果的重现性；,阴性结果的判定条件：1）最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量；2）各剂量组的组间差距不应过大。 阳性结果的判定条件：1）具有剂量-反应关系；2）有显著性差异；3）阳性结论含义不一。 常用的短期致突变试验：Ames 试验；哺乳动物细胞体内、体外染色体畸变分析；微核试验。,遗传毒理学相关的书籍和杂志,
