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艾滋病的实验室检查及其临床意义.ppt

上传人:kpmy5893 文档编号:4739331 上传时间:2019-01-09 格式:PPT 页数:34 大小:1.13MB
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资源描述

1、艾滋病的实验室检查及其临床意义 广州市第八人民医院传染病研究所,唐 漾 波,HIV感染者/ AIDS患者的诊断 1 临床体检及病史资料的分析,可提供重要线索,筛选出可疑患者。 2 HIV感染的病原学检查,以确定是否感染HIV。这是明确诊断的必备条件。 3 对机体免疫功能的检查,尤其是CD4+ 细胞的测定,是诊断AIDS的必备条件。,HIV感染者/ AIDS患者的诊断 4 对机会性感染的病原学和病理学检查,以确认AIDS的指针性疾病。如有复杂的表现不易解释和治疗,要考虑有机会性感染,通过活检、内窥镜、支气管肺泡灌洗(BAL)、穿刺等手段采取标本作病理检查,借助特殊染色或免疫组化、免疫荧光技术、P

2、CR、原位杂交等技术检测病原体。 5对肿瘤(主要是卡波西肉瘤和淋巴瘤)的病理学检查,对确定AIDS也很有必要。 6影像学检查,对患者的病变部位与范围进行确认与随访。,HIV的实验室检查 1、 HIV感染的诊断 (1) 检测HIV的抗体成分(首要检测指标) (2) 检测HIV的核酸成分 HIV 血浆病毒载量(HIV RNA load) (3) 检测HIV的抗原成分 (4) 病毒分离培养 2、 免疫功能的检查 (1) 细胞免疫功能的检查 (2) 体液免疫功能的检查 3、 机会性感染及肿瘤的诊断 (1) 感染病原体的诊断 (2) 感染部位病理学诊断,HIV-1的结构,电镜下,成熟的HIV-1病毒呈现

3、为一高密度筒状核心及一个脂类病毒外壳。 病毒表面是由72个刺突组成的20面体,每个刺突由34个病毒表面gp多聚体组成:gp120外膜蛋白,gp41跨膜蛋白,病毒内膜p17 病毒核心是由病毒RNA(由两条完全同源RNA链组成),病毒核心结构蛋白(p24Gag蛋白)和病毒繁殖所需的酶蛋白(包括逆转录酶蛋白p66,p53及整合酶)组成。,HIV-1复制周期,HIV主要抗原 gap基因(核心基因): 聚合蛋白p55主要核心蛋白p17、p24 核酸结合蛋白p15 pol基因(逆转录酶基因): p64、p53、p31 env基因(包膜基因): gp160(糖蛋白)gp120(包膜糖蛋白) gp41(跨膜糖

4、蛋白) 以上蛋白质均具有抗原性,可刺激机体产生相应抗体,其中p24和gp41抗原最有诊断意义,HIV主要抗体 感染HIV后一般于 13个月内产生抗体,由于HIV抗原成分多,抗体种类也较多,出现时间不同。 出现最早: gap蛋白(P24, P25)的抗体 同时或稍后出现: env蛋白(gp41, gp120, gp160)的抗体 pol蛋白(p66, p51,p31)的抗体 其中P24抗原和抗体可能随疾病进展而下降 gp41抗体较稳定而持久,是HIV主要的检测抗体,HIV感染的诊断程序: HIV初筛检测阴性发出阴性报告 阳性 HIV初筛检测阴性发出阴性报告 阳性 HIV确证检测 阳性 确定HIV

5、感染诊断,血清HIV抗体的检测 1HIV初筛检测 (1) 酶联免疫吸附法(ELISA) 方法:间接法、双抗体夹心法、竞争法 特点:灵敏性99.5%,特异性99.8%,简便易普及。 (2) 斑点免疫胶体金快速试验(金标法) 特点:快速、简便,但灵敏性、特异性均低于ELISA。 结果不能作为诊断依据,仅供参考。,血清HIV抗体的检测 2HIV确证实验 (1) 蛋白印迹(WB)检测法 方法:用已知的HIV-Ag(主要是gp160/gp120、p41、p13、p24)检测待测标本中的HIV抗体。 HIV-Ag:纯化的病毒蛋白质或基因工程抗原产物或人工合成的某段病毒多肽。 特点:特异性高,不需活病毒作抗

6、原,但操作较复杂。 (2) 其他:免疫荧光检测法(IFA) 放射免疫沉淀试验(RIPA) 条带免疫试验(LIA),3HIV抗体检测的主意事项 HIV抗体检测的阳性率受个体差异、病程进展、试剂敏感性和检测方法等许多因素的影响。 (1) 重复检验,或改用更敏感的方法检验。 (2) 定期复查:由于存在数周至数月的窗口期,需要于1.5月、3月、6月查三次。 (3) 检测HIV-2抗原或抗体。 (4) 病情严重病人或免疫严重缺陷者,可能不能检出抗体,需要直接检测HIV抗原、病毒基因或病毒颗粒。,一 检测HIV的核酸成分 1. RT-PCR技术:高效率、高敏感性、高特异性 RT-PCR定量技术:设置内参进

7、行定量测定HIV RNA load 2 bDNA技术:利用分支DNA信号扩增实验测定HIV RNA load。 特点: 特异性强,能排除污染的干扰,敏感性弱低于PCR技术 3. 分子杂交技术:同位素标记的HIV RNA探针,(三)HIV抗原的检测 1、检测方法:双抗体夹心ELISA法 p24抗原捕获实验 优点:简便、迅速,并可定量 缺点:敏感性低于病毒培养或PCR 2、临床意义 (1) 窗口期的诊断:感染HIV后约2周可检出HIV抗原(抗原血症),持续约68周;感染后13月,抗体出现,抗原浓度下降。 (2) 晚期判断预后:若HIV抗原再度出现伴p24抗体下降或消失,表示病毒复制活跃,是病情恶化

8、进展的标志。 (3) 判断新生儿是否感染HIV:新生儿因含有母体输送的HIV抗体(一般6个月内),需检测HIV抗原以确定有无垂直感染。 (4) 可用来评价抗病毒治疗的效果。,(四)HIV病毒的分离与培养 方法:从患者血液中分离淋巴细胞 在含有T细胞生长的液体中培养 用植物血凝素(PHA)刺激T细胞,使其转化成熟。 检测上清液中的逆转录酶或抗原,在该酶达到高峰时。 上清液与含HIV抗体的血清培养 形成免疫复合物而分离病毒 分离出的HIV用脐血淋巴细胞培养传代 特点:对病因诊断具有重要价值 但操作烦琐复杂,技术条件要求高,且阳性率不 高,难以在筛选中使用,目前主要用于病原学、流行病学及疫苗的研究。

9、,二 免疫功能的检查 (一)血液细胞学检查 AIDS血常规改变: (1) 75-85%的AIDS有轻-中度贫血,Hb100g/L (2) 白细胞400/mm3 (0.4x109/L),核左移现象。 (3) 外周血淋巴细胞明显减少,常1500/mm3 (1.5x109/L)或比例小于15% 。 (4) 血小板偏低,常低于10万/mm3 。 AIDS血常规检测的临床意义: (1) WBC的分类、计数及形态观察特别是淋巴细状况对评价免疫功能尤为重要。 (2) 监测抗病毒治疗过程中药物的毒副作用,细胞表面标记,细胞与介质间相互识别的物质基础是细胞膜分子,包括细胞表面的多种抗原、受体和其它分子。细胞膜分

10、子通常也称为细胞表面标记(cell surface marker)。 细胞膜分子的种类相当繁多,主要有白细胞分化抗原、T细胞受体(TCR)、B细胞识别抗原的膜免疫球蛋白、主要组织相容性复合体抗原、粘附分子、细胞因子受体、免疫球蛋白Fc段受体及其它受体和分子等。,白细胞分化抗原(CD),白细胞分化抗原,又称为族分化抗原(cluster of differentiation, CD) 是白细胞(包括血小板、血管内皮细胞等)在分化成熟为不同谱系(lineage)和分化不同阶段以及活化过程中,出现或消失的细胞表面标记。造血干细胞B祖细胞B前体细胞早期B细胞成熟B细胞造血干细胞T祖细胞T前体细胞早期T细

11、胞成熟T细胞,白细胞分化抗原(CD),T细胞在胸腺内的发育过程: 外层皮质 内层皮质 髓质CD4-/CD8- CD4+/CD8+ CD4+或CD8+10% 75% 15% 举例:CD45所有WBC表面标志CD3T细胞表面标志,CD19B细胞表面标志CD56NK细胞表面标志,CD11a淋巴细胞表面标志,流式细胞术,以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(微粒)的性状进行定性或定量分析的技术,流式细胞的基本信息: “形态”,(二)细胞免疫功能检测 1. 细胞免疫功能监测 破坏 HIV 破坏 感染 CD4+T淋巴细胞调控细胞因 子

12、(辅助性T淋巴细胞) 指令 HIV特异性CTL转化 CD8+T淋巴细胞 (细胞毒T淋巴细胞CTL),CD4+T淋巴细胞计数:其膜上存在HIV 包膜蛋白gp120受体,故HIV能特异性破坏CD4+T淋巴细胞,导致其进行性减少,其后果是细胞免疫功能衰竭,同时可出现各种机会性感染和肿瘤。 正常值:4101590cell /mm3 临床意义: (1)了解HIV感染者/AIDS患者的细胞免疫功能。 (2)选择抗病毒治疗时机(建议CD4+细胞为300cell/mm3时开始抗病毒治疗。 (3)监测抗病毒治疗效果。 (4)判断疾病预后有特别重要的意义。 CD8+T淋巴细胞计数:HIV感染早期细胞数增加,晚期减

13、少。 正常值:1901140cell /mm3 CD4+/ CD8+比值:降低。正常值:0.84.2,2、免疫重建评价 李太生教授等认为AIDS患者CD4+ T淋巴细胞数量的重建可分为两个阶段: (1) 快速增长期:抗病毒治疗的最初三个月,血浆HIV-RNA水平快速下降,CD4+ 、CD8+T淋巴细胞数量快速增长,进一步分析细胞表型提示,新增长的CD4+ T淋巴细胞主要为CD4+CD45RO+ T淋巴细胞(CD4记忆细胞),而CD4+CD45RA+ T淋巴细胞(CD4纯真细胞)无明显变化。 (2) 缓慢增长期:抗病毒治疗三个月之后,CD4+T淋巴细胞数量缓慢增长,进一步分析细胞表型提示, CD

14、4+CD45RO+细胞(CD4记忆细胞)增长变慢,而CD4+CD45RA+(CD4纯真细胞)开始启动增长。此阶段意味着真正的免疫重建。,3、免疫活化 HIV感染的持续存在导致了免疫系统各类不同的效应细胞的慢性活化。这种持续不断的免疫活化在某些情况下抑制了HIV的繁殖,阻止了HIV的扩散,产生有益作用。但在另外一些情况下,可引起免疫免疫系统的过度活化,破坏了正常的免疫调节,导致免疫衰竭。现在有不少学者认为HIV感染最终导致AIDS的根源所在应该归结于免疫活化。 T淋巴细胞免疫活化表现为:CD4+、CD8+T淋巴细胞表达的CD25、 CD26 、CD29 、CD69、CD38、HLADr细胞增加。

15、 我们的研究结果表明:HIV感染者/AIDS患者免疫活化程度与血浆HIV-RNA水平、患者病情程度呈很好的正相关关系,而与细胞免疫功能及免疫重建情况呈负相关关系;免疫活化标志的检测不仅能监测病情的程度,还有助于了解患者对治疗的反应。,免疫细胞表面的免疫活化标志: CD4+、CD8+T淋巴细胞表达的CD25、 CD26 、CD29 、CD69、CD38、HLADr细胞增加。,体液中的免疫活化标志,血清中T细胞免疫活化标志主要有 2-优球蛋白( 2-M)、新蝶吟(neopterin)、可溶性IL-2受体(SIL-2R)和可溶性CD8表型标志(SCD8)。 血情中B细胞免疫活化标志主要包括lgG、l

16、gM、lgA及循环免疫复合物(CICS)等。,4、细胞因子及其生物活性的测定: HIV感染引起的细胞因子变化,在HIV感染中,血清及PBMC中的一些致炎性细胞因子,如TNF、IL-6、IL-1 常常升高。 血清、PBMC、淋巴组织中的IFN-r常升高。 TNF 、IL-6在脑脊液中也可以查到。IL2常明显降低。 在HIV感染早期,以细胞免疫反应为主。所以T辅助细胞I型主要分泌的INF-r、IL-2常升高。 随着病程的发展,IL-2、IFN-r的水平逐渐下降,并逐渐向以体液免疫反应为主转变。所以,在HIV感染晚期,T辅助细胞II型主要分泌的IL-4、IL-5和IL-10水平逐渐升高。,(三)体液

17、免疫功能的检查:辅助项目 HIV感染者/AIDS患者非特异性体液免疫功能全面活化,特异性体液免疫功能底低下。 (1)细胞表面标志的检测 (2)B细胞功能状态的检查 (3)免疫球蛋白(Ig)的测定: lgG、lgM、lgA及循环免疫复合物(CICS)等。,三. 病理学检查 分为三个方面: 1、HIV感染直接引起的病变:主要为免疫系统和CNS的病变 2、机会性感染引起的疾病谱 病毒、细菌、原虫、真菌 条件致病菌、非条件致病菌 3、肿瘤性疾病:主要是卡波西氏肉瘤(KS)和恶性淋巴瘤(ML) 病理学检查方法: 1、尸体解剖(autopsy) 2、活体组织检查(biopsy) 常规病理检查、组织化学、免疫组织化学、电镜、原位杂交、原位PCR、流式细胞术、细胞培养、动物接种 3、细胞学检查,

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