1、动物繁殖学实验指导书1第一部分 必做实验实验一 畜禽生殖器官的解剖与观察一、实验目的：1. 了解哺乳动物和禽类生殖器官的解剖学特征及其结构与功能的关系；2. 重点掌握兔和鸡的生殖器官的位置，形态和两者的比较特征。二、材料和方法：1. 材料：兔子（两公两母） ，鸡（两公两母） ，手术器械一套（剪刀、镊子、手术刀） ，50mL 注射器一个，大小托盘各一个。2. 方法：（1）兔： 抓兔：从颈后部用右手抓住兔子的两个耳朵，防止兔子因痛而回头咬人，左手抓住兔子的臀部。 保定：两人合作，一人左手抓住后肢，双脚夹在一起抓，右手压住兔子的躯体，另一人抓住兔子的前肢和双耳根部，兔子爪子锋利，操作要小心被划伤。
2、剪毛：在兔子的耳朵背上缘侧找到耳静脉，用毛剪或用手将附近的细毛除去。 处死：用 75%的酒精棉球擦拭去毛部位，是耳静脉膨胀，便于插针，若效果不明显，也可用手指轻弹耳静脉，使其充血膨胀。右手拿注射器，左手指固定兔耳朵，插针前先抽入 20mL 空气，然后插针。使针头斜面向上，斜 45 度角方向插进兔子耳静脉，然后将空气推进。 剪毛：待确定兔子死亡后，先用少量水弄湿腹部的毛，防止剪毛时毛屑乱飞，剪毛时要贴着皮肤剪，剪下的毛放入装有水的烧杯中，不能丢在托盘上。 解剖：首先剪开皮肤，在腹部中间位置剪开一个小口，操作时可用镊子或手将皮肤拉起，然后往上下两边分别剪开皮肤，这时就可以看见腹中线，用镊子夹起腹中
3、线两侧的肌肉，用手术刀在腹中线上划开一个小口，然后在镊子或者手指的引导下剪开腹肌，往上剪到胸部软骨位置，往下剪到盆骨腔。此时就可以看见兔子的内脏器官，将内脏扒向一边，便可以看见生殖器官。 分离生殖器官：首先要切断耻骨联合除，否则很难分离出完整的生殖器官。公兔生殖器官按照睾丸、附睾输精管副性腺阴茎的顺序分离；母兔生殖器官按照卵巢输卵管子宫阴道外阴的顺序分离。 剥皮：分离生殖器官完毕后，将兔子的皮剥去。（2）鸡： 放血：采用颈部放血发。一人左手抓住鸡的双脚，右手抓住翅膀根部，另一人左手抓住头部，食指和拇指夹住颈部皮肤，使左右两条颈静脉挤向中间，然后用剪刀剪断颈静脉，待学流干鸡挣扎死亡后才可松手。
4、去毛：采用湿拔法。水温 90左右。先烫鸡的双脚，待脚上的皮能剥下时即可烫身上的毛，烫毛时要轻轻摆动，便于翅膀下等隐藏出的毛也能烫到。 解剖：先用手术刀割破大腿内测的皮肤，双手抓住两只腿逆向扒开，使大腿骨脱臼，鸡便可平稳的放于托盘上。用剪刀在腹部泄殖腔上 2 厘米处开一小口，然后向上剪开腹肌，掰开腹肌和胸肌，然后把内脏拨开，便可见生殖器官。2 分离生殖器官：公鸡：先切断睾丸背系膜，分离出睾丸，顺着输精管往下一直分离到泄殖腔，将整个泄殖腔剪下。母鸡：先切断卵巢系膜，沿着腹腔背侧系膜，剪下输卵管系统。三、哺乳动物与禽类生殖器官的解剖学特征观察（1）公兔：睾丸、附睾、输精管、副性腺、阴茎、阴囊 睾丸位
5、置：阴囊腔内，一对。形态：卵圆形。浆膜结构 白膜小叶功能：生精作用，分泌雄激素、产生睾丸液。 附睾位置：睾丸背侧缘形态结构：由头、体、尾三部分组成，头尾两端粗大，体部较细功能：精子成熟的产所，储存精子，运输精子。 阴囊：皮肤组织，包被睾丸、附睾。阴囊能调整其壁的厚薄，保持睾丸温度低于体温，维持生精机能。 输精管位置：附睾尾端延续形成。形态结构：精索部输精管壶腹部射精空。由内而外分为黏膜层、肌层和浆膜层。功能：输送精子，分解、吸收死亡、老化的精子。 副性腺：精囊腺、前列腺和尿道球腺统称为副性腺。精囊腺：一对，位于输精管末端外侧，扁平囊状。前列腺：复管状，分为体部、扩散部。尿道球腺：一对，尿生殖道
6、盆骨部外侧，分为两叶。功能：稀释精子，提供营养。 阴茎：由海绵体和尿道海绵组成。形态结构：圆柱状，前端稍弯曲。作用：排尿，交配。（2）母兔：卵巢、输卵管、子宫、阴道 卵巢位置：1 对位于腹腔腰部，肾脏的后方，有卵巢系膜悬于腰椎体壁上。形态：卵圆形。皮质部（外周）：含有卵泡、闭锁卵泡、黄体等。结构 髓质部（中央）：疏松结蹄组织，富含血管、神经。功能：产生卵细胞，排卵，分泌雌激素和孕酮。 输卵管位置：连接卵巢和子宫的结构，包在输卵管系膜内。形态：分为壶腹部、峡部和伞部。结构：由内而外分为黏膜层、肌层和浆膜层。功能：运送卵子，精子受精产所。3 子宫位置：与输卵管末端相连。形态：左右子宫全部分离，没有
7、任何程度的愈合，属于双子宫类型。结构：由内而外分为黏膜层、肌层和浆膜层、功能：胎儿发育的产所，为胎儿提供营养。 阴道位置：位于盆骨腔，前接子宫，后连阴道前庭，背侧为直肠，腹侧为膀胱和尿道。形态：管状。功能：交配，分娩产道，交配后储存精子。（3）公鸡：睾丸、睾丸旁导管系统、输精管、交媾器 睾丸位置：一对，由睾丸系膜吊于腹腔体中线背系膜两侧，约在最后两个肋骨上部。形态：豆形，乳白色，通常左侧的比右侧的大。结构和功能同兔子睾丸。 睾丸旁导管系统位置：睾丸背内侧缘。形态：长纺锤形的膨大物。结构：由睾丸网、输出小管、附睾小管和附睾管组成。功能：精子进入输精管的通道。 输精管位置：前接附睾管，沿肾脏内侧腹
8、面与同侧的输尿管在同一结缔组织鞘内后行，到肾脏后端时，输精管越过输尿管腹面，沿着其外缘进入腹腔后部。形态：一对，呈极端螺旋状，末端突出与泄殖腔腹外侧壁的输尿管口的腹内侧。功能：储存精子，输送精子。 交媾器位置：位于泄殖腔后端腹区。形态结构：由四部分组成：输精管乳头、脉管体、阴茎体和淋巴襞。功能：交配。（4）母鸡：卵巢、输卵管系统 卵巢位置：由卵巢系膜悬吊于腹腔背侧，前端与肺相接。形态结构：扁椭圆形，表面呈桑椹状，常见有体积不等的卵泡。功能：产生卵子，排卵。 输卵管系统位置：通过双层系膜悬吊于腹腔顶壁。形态结构：长而弯曲。由下面五个部分组成：漏斗部：位于卵巢正后方，获取卵子并纳入输卵管内，是精子
9、受精产所。膨大部：输卵管中最大最弯曲的部分，是形成带白的部位。峡部：略窄且较短，是形成卵内、外壳膜的部位。子宫：形成稀蛋白，子宫腺分泌物物形成蛋壳，分泌色素。阴道：交配，暂时储存精子。4四、实验结果1. 认识哺乳动物和禽类的生殖器官位置、形态及解剖学特点。2. 观察公兔、母兔、公鸡和母鸡的生殖器官的构造，并且比较公兔和公鸡、母兔和母鸡生殖器官的差异。五、作业：1. 画 4 个图：公兔、母兔、公鸡、母鸡的生殖系统图。2. 比较公兔和公鸡，母兔和母鸡生殖系统的异同。5实验二 动物生殖器官的组织学观察一、目的和要求1. 观察牛的睾丸、卵巢、输卵管、黄体、子宫等生殖器官组织切片，了解其形态、结构和功能
10、。2. 了解精子发生、卵子发生和卵泡发育的过程及精子、卵子、和卵泡的形态、结构和功能。二、材料和方法1. 材料：牛的生殖器官组织切片（睾丸、卵巢、输卵管、黄体、子宫） ，显微镜2. 方法：应用显微镜观察牛的生殖器官组织切片。显微镜使用方法：取镜插上电源检查光圈大小、光源亮度（注意光圈最大、光源最小原则）打开电源开关调物镜至低倍放片对光调焦距观察结束后先把光源调至最小，再关电源。三、动物生殖器官组织切片的观察（1） 卵巢先在 10 倍物镜下观察，了解其整体组织学构造。生殖上皮：单层或立方柱状上皮，随着年龄的增长会趋于扁平。白膜：致密的结蹄组织，对卵巢起着支持和保护作用。皮质：有黄体和各种时期的卵
11、泡在其中，注意区分黄体和卵泡的区别：显微镜下黄体着色均匀，黄体细胞明显，而卵泡细胞有多种类型，有深红色的卵母细胞可见。髓质：疏松结蹄组织，富含血管、淋巴管及神经。由于卵巢切片时纵切，显微镜下很难区分髓质的结构，观察时要注意。然后把倍物镜调至 40 倍，观察卵泡的发育过程。原始卵泡 初级卵泡 次级卵泡 三级卵泡 成熟卵泡无腔卵泡（腔前卵泡） 有腔卵泡球形，体积小，数量多，由卵母细胞和周围单层扁平颗粒细胞构成。体积增大，扁平颗粒细胞变为立方颗粒细胞，有透明带形成。卵母细胞被多层立方颗粒细胞包围，有卵泡膜形成。体积更大，出现卵泡腔和放射冠。体积最大，卵丘明显，染色质少核仁明显。（2）黄体成熟卵泡排卵
12、后，颗粒细胞增生变大，吸取类脂而变黄，成为黄体。根据所处的时期不同可分为红体、黄体和白体三种。红体：成熟卵泡排卵后，血管破裂，血液进入卵泡腔，形成的血凝块。黄体：血细胞被吸收，颗粒细胞吸收类脂质而演化为黄体细胞。白体：由黄体细胞退化形成。黄体细胞退化为成纤维细胞，黄体变小，形成白癍。功能：分泌孕酮，维持妊娠。6（3）输卵管：由漏斗部、壶腹部、峡部组成。由内而外分为黏膜层、肌层和浆膜层。黏膜：由粘膜上皮和固有膜组成。粘膜可以形成皱褶，适于卵的停留、吸收营养和受精。壶腹部皱褶最多，靠近子宫越少。肌层：分为内环肌和外纵肌，内环肌着色深，细胞排列紧密；外纵肌着色稍浅。肌层的厚度由卵巢向子宫端逐渐增厚，
13、峡部最厚，肌层的收缩有利于卵向子宫移动。浆膜：由疏松的结蹄组织形成。（4）子宫：子宫壁分为三层：粘膜、肌层和外膜。粘膜：由上皮和固有膜构成。上皮陷入固有膜形成子宫腺，具有分泌作用；固有膜为环形结蹄组织，之间含有大量淋巴、血管、子宫腺。肌层：有内环肌和外纵肌构成。内环肌较厚，外纵肌比较薄，内环肌和外纵肌之间为血管层，其中有神经分布。外膜：为浆膜，由疏松结蹄组织和间皮构成。（5）睾丸：由被膜、睾丸纵隔和中隔、睾丸小叶构成。被膜：由浆膜和白膜构成。外层浆膜为固有鞘膜，较薄；内层白膜为白色的结蹄组织。纵隔和中隔：纵隔为睾丸的一端伸向睾丸实质的结蹄组织索；纵隔向四周发出许多放射状的结蹄组织小梁称为中隔，
14、伸向白膜。睾丸小叶：中隔将睾丸实质分成许多小叶，小叶尖端朝向中央，基部朝向睾丸表面。然后在高倍镜下观察睾丸小叶的结构和精子的发育过程：间质细胞：分布于间质细胞之间，体积较大，近似卵圆形或多角形，核大，有分泌雄性激素的功能。小叶 结蹄组织曲精细管 基膜 足细胞：体积较大，细长，核大，数量较少。有支持、营养和保护生精细胞的作用。生殖上皮生精细胞：数量多，分布于足细胞之间。根据其发育阶段和形态特点又可分为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子。观察精子的发育过程：见下表。精原细胞 初级精母细胞 次级精母细胞 精子细胞 精子体积小，圆形，紧贴基膜，是形成精子的干细胞。位于精原细胞内侧，体
15、积较大，核呈球形。体积较小，圆形，染色质呈细粒状。由于很快分裂为两个精子细胞，所以显微镜下较难发现。靠近曲精细管管腔，体积小，胞浆少。位于或靠近曲精细管管腔，有头尾，呈蝌蚪状。尾部朝向管腔。四、实验结果1. 观察家畜睾丸、卵巢的组织切片，了解家畜睾丸、卵巢的组织结构及形态。2. 思考动物生殖器官的构造与其功能的关系。3. 对精子的发生和卵子的发生、卵泡的发育过程及其形态有一了解。7五、作业：画图：卵巢（包含各个时期的卵泡） 、黄体、输卵管、子宫、曲精细管的组织结构图。实验三 人工受精器材的认识和假阴道的安装一、目的和要求1. 熟悉人工受精所用的采精和输精器材，了解其用途及使用方法；2. 练习和
16、掌握假阴道的安装步骤和方法。二、材料和器械设备1. 采精器材：牛、羊等动物采精用的假阴道2. 输精器材：细管型冷冻精液输精器、阴道开张器3. 辅助器材及药品：高温灭菌器、长柄钳、玻璃棒、棒状温度计、凡士林、75%和95%的酒精棉球、来苏儿等。三、方法和步骤（一）人工受精器材的认识1. 假阴道：由外壳、内胎、集精杯和橡胶漏斗、胶圈等组成。外壳：由硬橡胶或塑料制成的圆筒，中部有可吹气、注水和排水的开关。内胎：优质橡胶制成的胶筒。集精杯：双层的棕色集精杯或有刻度的离心管。橡胶漏斗：连接假阴道和集精杯。其他部件：胶圈（用于固定内胎） ，气卡（充气和调压）2. 输精器：金属制成的细管型冷冻精液输精器（二
17、）假阴道的安装1. 假阴道外壳及内胎的检查： 检查外壳有无裂缝或小孔，两端是否光滑； 检查假阴道内胎是否漏气，内胎的光滑面是否在里边，边缘是否有裂口； 检查气门活塞是否有裂口或漏气，扭动是否灵活。2. 采精器材的清洗： 外壳、内胎、集精杯、橡胶漏斗等用具用热的洗衣粉水清洗，特别注意清洗内胎上的污渍。 用清水洗净洗衣粉，再用蒸馏水或生理盐水冲洗，自然干燥后即可使用。3. 内胎的安装： 装内胎：将假阴道内胎装入外壳中，光滑面应朝向内腔。把假阴道外壳夹在安装者的大腿之间，使内胎的两端翻卷于外壳两端上，注意使内胎不得扭曲，内胎的中轴应与外壳中轴重合，即内胎的两端和外壳的两端应成为同心圆位置；8 固定：
18、然后用橡皮圈将两端扎紧固定。4. 消毒：用长柄钳夹取 75%的酒精棉球擦拭内胎、集精杯和橡胶漏斗，再用 95%的酒精棉球充分擦拭。注意消毒必须从内向外旋转，一侧消毒完，在消毒另一端；待酒精挥发完全后，再用 0.9%生理盐水洗 23 遍。5. 集精杯的安装：借助橡胶漏斗使其与假阴道相连。6. 注水：通过注水孔向假阴道内外壁间注入 5055的温水，使其在采精是温度保持在 3840，注水量约为内外壁容积的 1/31/2。7. 涂润滑剂：用消毒过的玻璃棒取少量灭菌凡士林，均匀涂于内胎一端的表面，涂抹部位为假阴道全长的 1/22/3，注意涂抹不宜太多，以免混入精液影响精液品质。8. 调节假阴道内腔压力：
19、安装气门活塞，从注气孔打入空气，调整内腔压力，使假阴道入口处出现三个半圆形的皱襞为宜。9. 假阴道内腔温度的测量：用消毒过的温度计插入假阴道内腔，待温度不变时再读数，一般要求 40左右为宜。10. 防尘：用消毒过的 24 层纱布盖住假阴道入口，防止灰尘落入，即可准备采精。（三）输精器材的使用1. 金属输精枪和阴道扩张器在使用前要高温灭菌。150 磅，30 分钟。2. 细管型冷冻精液输精枪由金属外壳和里面的推杆组成。前端的金属套不能连续使用，每次输精完毕必须更换。3. 使用时先减去细管冷冻精液没有棉花的一端，然后将有棉花的一端插在输精枪的推杆上，套上前端的金属套，即可准备进行输精。四、实验结果1
20、. 了解人工受精所采用的采精和输精器械的用途及使用方法。2. 练习并掌握牛假阴道的安装方法。五、作业试述牛假阴道的组成及安装时的注意事项。9实验四 冷冻精液的解冻、稀释、精液品质鉴定和观察理化因素对精子活率的影响一、实验目的：1. 掌握冷冻精液的解冻方法；2. 掌握精液品质鉴定的实验室操作方法；3. 了解和观察理化因素对精子活率的影响。二、实验材料：液氮罐、牛的细管型冷冻精液、显微镜、恒温水浴锅、血球计数板、玻片、温度计等。三、实验方法：1. 冷冻精液的解冻将冷冻细管精液从液氮罐中取出，立即投入 3941的热水中，溶化后取出。2. 精液稀释：稀释液为 2.9%的柠檬酸钠溶液。按 12 的比例稀
21、释。预热：取 0.5mL 2.9%的柠檬酸钠溶液于试管中，把试管放入装有热水和温度计的大烧杯中预热，使稀释液的温度为 3840，便可进行稀释。稀释：取解冻后的细管精液一支，先剪断没有棉花的一端然后倒转细管，使剪断的一端对着装有稀释液的试管，剪断另一端，精液便自动流入试管中，轻轻摇匀或用细管吹打使之混匀。保存：稀释后的精液保存与 3537的温水中，以便进行下面的精液品质鉴定。3. 精子活率测定精子活率是指精液中呈直线前进运动的精子数占总精子数的百分比。精子活率是精液品质鉴定的重要指标，受精能力与直线前进运动精子数的多扫密切相关。 滴片：用细管吸取一小滴精液与载玻片上，不要有气泡。 盖篇：先使盖玻
22、片的一端与精液的边缘相连，然后斜 35 度角轻轻盖上，要求不能有气泡。 镜检：在 1040 倍下观察，总共数 200 个精子，记下直线前进运动的精子数。注意：观察时显微镜亮度不能调太大，不然很难观察到精子。每个同学要求做两张片，若结果相差 10%以上，则要重做。显微镜下观察到精子有三种活动类型：直线前进运动、旋转运动、原地摆动。精子活率= 直线前进精子数/ 总精子数 100%104. 活精子百分率测定：滴片加一滴 37预热的 5%曲利本蓝混匀静置 35 分钟镜检。显微镜下观察，总共数 200 个精子。头部着色的为死精子，活精子不着色。因为死精子因其头部膜受损，染色液可渗入到细胞内而使细胞着色，
23、活精子有完整的细胞膜，染液不易渗入，精子不着色。活精子百分率= 活精子数/ 总精子数 100%5. 观察理化因素对精子活率的影响加深验证环境因素的变化对精子生理功能的影响。高温（在酒精灯上烘烤片刻）温度 室温低温（放入冰箱 35 分钟）精液一滴+75%乙醇一滴化学药品 精液一滴+2%来苏儿一滴精液一滴+1/1000 新洁儿灭一滴精液一滴+蒸馏水一滴渗透压 精液一滴+3%氯化钠一滴精液一滴+0.9%氯化钠一滴结果填入下表中环境因素 精子活率高温室温温度地温75%乙醇2%来苏儿化学药品1/1000 新洁儿灭蒸馏水3%氯化钠渗透压0.9%氯化钠6. 精子形态观察和畸形率的测定威廉氏染色法（石碳酸复红
24、染色法）：抹片干燥（风干或火焰烘干）无水乙醇固定 23 分钟风干浸入 0.5%氯胺 T12 分钟水洗迅速通过 96%乙醇 风干石碳酸复红染色 1015 分钟水洗迅速通过美兰染色液风干镜检。蓝墨水染色法：抹片干燥福尔马林缓冲液固定 1015 分钟水洗干燥蓝墨水染色 810 分钟11水洗干燥镜检。显微镜下观察精子的形态，总共数 200 个精子，计算精子畸形率。畸形精子包括：头部畸形（巨头、小头、窄头、梨形头、双头、头基部过宽或狭窄等）尾部畸形（无头、单卷尾、环形卷尾、双尾、带原生质滴等）中段畸形（颈部肿胀、中段纤丝裸露、中断螺旋、双中段等）精子畸形率= 畸形精子数/ 总精子数 100%7. 精子顶
25、体的观察抹片风干福尔马林磷酸盐固定液固定 15 分钟水洗风干235Giemsa 染色液染色 15 分钟水洗风干镜检。每个同学要求做两个片，总过数 300 个精子，结果相差若超过 15%，则要重做。精子顶体的类型分为 4 种：顶体完整型、顶体膨胀型、顶体破损型和顶体全脱型。精子顶体完整率= 顶体完整的精子数/ 总精子数 100%8. 精子密度计数粗略计数法：（可与测精子活率同时做）滴片后直接镜检，根部目测的精子稀疏程度把精子密度分为密、中、稀三个等级。密：精子间彼此空隙很小，看不清各个精子个体运动情况。每毫升精子数约 10 亿以上。中：精子之间空隙明显，约有一个精子的长度。每毫升精子数在 210
26、 亿之间。稀：视野中精子稀疏、分散，精子间的空隙超过一个精子长度。每毫升精子数在 2 亿一下。血球计数板板计数法：a. 在计数板的计数室上推上盖片；b. 把计数板放到显微镜下，找到清晰的计数室；看清其构造；c. 用吸管吸取少许精液，使吸管尖端置于计数室和盖玻片交界处，让吸管内的精液自动渗入计数室内，注意不能使精液溢出盖玻片，也不能有气泡，否则应重新操作。d. 镜检和计数。计数时只要数出四角和正中间五个方格的精子数，对于压线精子采用“数上不数下，数左不数右”的原则。计算精子数：1mL 原精液内的精子数=5 个中方格的精子总数5101000稀释倍数四、实验结果1掌握精液解冻及精液品质鉴定的实验室操
27、作方法。2了解理化等环境因素的变化对精子活率的影响。3掌握不同要求的精子染色方法。12实验五 人工授精、母牛的直肠检查一、实验目的1. 掌握牛直肠检查的基本操作方法。2. 熟悉母牛生殖器官各部分的自然位置、形状、质地及相互关系，为通过直肠检查鉴定母畜发情状态、妊娠及生殖器官疾病诊断奠定基础。3. 练习人工输精的操作方法。二、实验材料1. 母牛若干头2. 保定架、保定绳、开张器、手电筒、输精器、托盘、瓷盆等3. 洗衣粉、石蜡油、新洁儿灭、肥皂、75%酒精棉球三、实验内容（一）直肠检查1. 将受检母牛保定与保定架内，防止检查人员被踢伤，并将受检母牛的尾巴拉向一侧。2. 用洗衣粉水清洗母牛外阴部并擦
28、干净。3. 检查者先将手臂用洗衣粉水洗净，然后清水冲洗干净，再用 75%酒精棉球擦拭一遍，接着在手臂上涂以石蜡油润滑。4. 检查者站立于被检母牛的正后方，并抚摸肛门（起安抚作用） ，将手指并拢成楔状，手心向上，以缓缓地旋转动作伸入肛门。5. 手臂伸入肛门后，直肠内如有宿粪，要以手指掏出。掏出粪便时，手掌须展平，少量而多次地取出，切勿抓粪一把向外硬拉。6. 手伸入直肠后，手心向上贴着椎体向前移动，在岬部前方可摸到腹主动脉的最后一个分支髂内动脉，其根部的第一分支即为子宫动脉，沿着动脉向下可摸到一个坚实的、纵向似13棒状物即为子宫颈，再沿一侧向前可摸到子宫角和卵巢。7. 根据卵巢的形状、有无卵泡、卵
29、泡的大小、质地等情况来判断母牛的妊娠状况。8. 注意事项： 检查过程中，时刻提防母畜蹴踢。母牛后腿的外展肌发达，因此，操作者不宜站在母牛的外侧，而应站在母牛的正后方。检查者的指甲必须剪短锉圆，并要磨光。 检查者的手臂上须涂以润滑剂，切忌用干涩的手臂向母畜肛门内硬插。 在直肠内探摸过程中，只允许使用指肚，切不可用指甲乱抠、乱抓、乱划。 检查动作应轻缓，对于不知生理状态的母畜，尤应注意动作轻缓，以免造成孕畜流产。（二）人工输精1. 清洗外阴部，消毒开张器。2. 将消毒多的开张器顺着阴门裂方向合并 45 度呈侧向插入阴道，送入阴道后转向 90 度使手柄向下。3. 打开开张器，进行观察：阴道粘膜、子宫
30、颈、子宫颈粘液、子宫颈口。4. 另一只手持输精器，由阴门插入，先向上倾斜插以避开尿道，然后平直插入，直至子宫颈口处。5. 将输精器前端插入子宫颈内约 58cm 处（接近子宫颈口内） ，随即注入精液。四、实验结果1. 掌握母畜直肠检查的方法。2. 叙述牛直肠检查触摸卵巢的要领，并说明其位置。3. 试述直肠检查母牛子宫的特点。实验六、鸡精液采集、冷冻保存、解冻及人工输精（综合性实验）一、教学目的1.以鸡的人工授精为例，通过实验使学生熟练掌握精液采集、精液品质分析、精液冷冻与保存以及人工授精的基本技术，为毕业后从事动物繁殖等技术工作打下基础。2.进一步理解精液冷冻保存的原理，熟悉精液冷冻保存的程序，
31、巩固学生实验基本操作技能，提高学生实践操作能力。二、实验内容141.购买公鸡、母鸡并进行人工饲养2.学习采集公鸡精液的技术，采集精液3.掌握精液采集与精液品质评定的方法。对公鸡精液进行稀释，并进行精液品质分析；4.配制精液稀释液，冷冻保护液5.拟定了精液冷冻程序方案；6.进行精液冷冻、解冻；7.进行人工授精、孵化8.照蛋，确认是否受精三、实验方案1.染色液、精液稀释液、冷冻保护剂和解冻液的配制（1）染色液：威廉氏染色液:夏红（又称品红）染色液：复红原液（10g复红溶于100ml 96的酒精）10ml加5的石炭酸（苯酚）100ml。取上述混合液50ml加饱和伊红酒精溶液25ml放置两周后即可使用
32、。美蓝（又称甲基蓝）染色液：美蓝溶液（10g美蓝溶于1000ml 96的酒精中）30ml加0.01KOH 100ml过滤后在加入3倍量的蒸馏水，混合后即可使用。威廉氏染色法（石碳酸复红染色法）染色程序：抹片干燥（风干或火焰烘干）无水乙醇固定 23 分钟风干浸入 0.5%氯胺 T12 分钟蒸馏水洗迅速通过 96%乙醇风干石碳酸复红染色 1015 分钟蒸馏水洗（2 次）迅速通过美兰染色液水洗后风干镜检。蓝墨水：5曲利本蓝：基础液：氯化钠 0.8g 氯化钾 0.02g 磷酸氢钠 0.156g 磷酸二氢钾 0.02g蒸馏水100ml再称取0.5g曲利本蓝加入到100ml的基础液中，配制后置于4中保存。
33、（2） 冷冻稀释液：取80ml 5.7%蔗糖溶液，加入20ml卵黄液，配成100ml含卵黄20%的冷冻稀释液液，加入0.003g青霉素，0.005g链霉素，摇匀，4预冷保存。（3） 冷冻保护剂：甘油冷冻保护液：取出17.2ml冷冻稀释液，加上2.8ml的无水甘油，配成含甘油14%的冷冻保护剂液, 充分摇匀后，4预冷保存。15DMSO冷冻保护液：取出17.6ml冷冻稀释液，加上2.4ml的DMSO，配成含DMSO14%的冷冻保护剂液, 充分摇匀后，4预冷保存。（4）解冻液：5.7%的葡萄糖溶液2.精液采集采用背腹式按摩法采集种公鸡精液，采集过程中要求精液无粪便，无血液，饲料等污染。采集后用棉花和
34、纱布包好，置于保温杯中，送回实验室处理。（1）公鸡的采精，可由一个人单独操作，采精者可蹲下或坐下，并将公鸡两脚夹於膝盖间，以公鸡头部朝右放好，左手持精液收集管收集之，或由双人操作，一人固定公鸡，另一人采精。（2）先清除泄殖腔附近之羽毛，以减少精液污染的机会。（3）用左手轻轻按摩公鸡鞍部，另一只手可以轻轻地触摸其腹部，向尾部方向按摩，按摩鞍部使公鸡尾部翘起来。（4）操作者会感觉到公鸡的两脚稍微变硬而直，尾部更明显地竖立起来。（5）继续按摩，呈一定的节律性，就会使泄殖腔内的生殖突起竖起，此时必须立刻用手轻轻压挤已经肿胀的精管乳头使精液射出，并以另一手持收集管接住。3精液的稀释（1）精液采集后应尽快
35、稀释，原精贮存不超过30分钟；（2）未经品质检查或检查不合格（活力0.8以下）的精液不能稀释；（3）稀释液与精液要求等温稀释，两者温差不超过1，即稀释液应加热至33-37，,以精液温度为标准，来调节稀释液的温度，绝不能反过来操作；d、 稀释时，将稀释液沿盛精液的杯(瓶)壁缓慢加入到精液中，然后轻轻摇动或用消毒玻璃棒搅拌，使之混合均匀；（4）如作高倍稀释时，应进行低倍稀释（1：1-2） ，稍待片刻后再将余下的稀释液沿壁缓慢加入，以防造成“稀释打击” ；（5）稀释倍数的确定：活率0.8的精液，一般按每个输精剂量含0.5-0.6亿个总精子，输精量为0.05ml确定稀释倍数，例如：某只公鸡一次采精量是
36、0.5ml ，活力为0.85，密度为35亿/ ml，要求每个输精剂量是含0.5亿精子，输精量为0.05ml，则总精子数为0.5ml35亿/ml=17.5亿，输精头份为17.5亿0.5亿=35份，加入稀释液的量为3500.05ml-0.5ml=17ml；（6）稀释后要求静置片刻再作精子活力检查，如果稀释前后活力相差不大，即可进行分装与保存，如果活力显著下降，说明稀释液的配制或稀释操作有问题，不宜使用，并应查明原因加以改进；16（7）不能随便更改各种稀释液配方的成分及其相互比例，,也不准几种不同配方稀释液随意混合使用；4.精液冷冻前鲜精品质评价在装有 10ml 5.7%的葡萄糖溶液的离心管中，用移
37、液枪移 100ul 鲜精，稀释 100 倍，混打均匀后，进行精液品质评价。精子活率：活率是指呈直线运动的精子百分率，在显微镜下观察精子活率，一般按0.1-1.0 的十级评分法进行，鲜精活率要求不低于0.8。要求用血细胞计数板进行计数。血细胞计数板计数方法：在血细胞计数室上放一盖玻片，用微量加样器取稀释精液100l，取1滴入计数板的槽中，靠虹吸将精液吸入计数室内；在高倍镜下计数5个中方格内的非直线运动的精子总数。精子活率=（精子总数非直线运动的精子总数）/精子总数精子密度：指每毫升精液中所含的精子数，是确定稀释倍数的重要指标。同样要求用血细胞计数板进行计数，在高倍镜下计数5个中方格内的精子总数，
38、精子畸形率：畸形率是指异常精子的百分率，一般要求畸形率不超过18。用威廉氏染色法染色，镜检，观察活精子的畸形率。畸形精子种类很多，如：巨型精子、短小精子、双头或双尾精子，顶体膨胀或脱落、精子头部残缺或与尾部分离、尾部变曲。比较威廉氏染色、5%曲利本蓝、蓝墨水的染色效果。鲜精存活时间：从稀释开始计时，常温下每隔30min计算一次精子活率，直到精子全部死亡为止。直接用玻片，计算一个视野内的精子活率，记录精子存活时间，计算精子生存指数。5.冷冻精液制作鲜精经过品质检测合格后，方可进行冷冻精液的制作。精液冷冻前的准备：取 1ml 的鲜精，用相同温度的冷冻稀释液进行 1：3 的稀释后，然后用纱布包上 1
39、0 层，放在 0-5左右的冰箱中预冷 1 小时左右，再用相同温度的含甘油的冷冻保护剂(或含有 DMSO 的冷冻保护液)进行 1:1 的稀释接着在 5的冰箱中进行平衡 2 个半小时。平衡时间可以在 1 个小时至 3 个小时内变动，学生可以比较不同平衡时间精液冷冻的效果。精液冷冻：用泡沫盒盛装液氮，在距离液氮面 12cm 处架上铜丝网，待铜丝网充分冷却后，用移液枪开始滴冻，每滴 0.25ml。滴冻后加盖，熏蒸 2 分钟，然后将颗粒浸入液氮中。6.冷冻精液解冻17取 0.5ml 5.7%的葡萄糖溶液，放入小试管内，浸入 40热水中经 2-3 分钟后，投入精液颗粒，待溶化 1/2-1/3 时，取出试管
40、，当精液全部溶化后，进行精液评定7.冻精品质评价将解冻后的精液按 1：5 稀释后，进行精液品质评价，评价指标与方法和鲜精的相同。要求精子活率0.35 以上，方可进行输精。8.人工输精将解冻后的精液，按 0.2ml/只鸡的量进行人工输精。母鸡的头部朝下，尾部面向操作者。左手夹住两脚，并使母鸡腹部靠紧鸡笼。左手施压於左边的腹部，并用右手指拉下泄殖腔旁的表皮，使阴道翻出。授精者将授精器前端细管插入阴道内，并利用针筒或连续注射器将精液注入阴道内。抓住母鸡者，此时须放松压力，使精液能留在阴道深部，然後授精者将细管抽出完成授精。四、实验结果分析 比较不同染色剂对精子畸形率的染色效果； 比较精液冷冻前后精液
41、品质指标的变化情况； 比较不同解冻温度对精液品质的影响。五、体会试叙述通过实验，您在动物繁殖学基础知识和基本技能方面所取得的收获及体会。18第二部分 选做实验 选做实验一 孕马血清促性腺激素（PMSG）效价的生物测定一、目的和要求PMSG 是由马（驴）的子宫内膜杯状细胞所分泌的一种糖蛋白激素。兼有促卵泡素（FSH）和促黄体（LH）双重生物学活性，但以 FSH 活性为主。母马在妊娠 40d 左右在血液中出现。170d 左右消失。本试验的目的在于：用生物学方法测定妊娠母马血清中的PMSG 的含量，用生物学单位来判定其效价。 校验商品 PMSG 生物制剂的生物效价。通过实验要求学生熟练掌握 PMSG
42、 生物测定方法。为将来进行家畜繁殖方面的科研、教学和畜牧生产实践打下基础。二、实验原理某一激素对靶器官起作用，靶器官产生特点的生理反应。PMSG 能促进动物卵泡发育成熟，引起发情和排卵，也能引起卵巢和子宫的发育。以小白鼠子宫发育增大为测定活性的根据，测定该激素引起小白鼠子宫阳性反应的最低有效浓度，从而计算样品的活性效价，即为该样品的 PMSG 的小白鼠单位 /毫升（MU/ml） 。三、材料1. 实验动物 选择同品系的、2021 日龄（未到性成熟，阴门未开张） 、体重为 1012g 的雌性健康小白鼠 90 只。小白鼠只数可因人多少而变动。2. 测试样品 PMSG 生物制剂或孕马血清。3. 器械及
43、药品 1ml 注射器、 4 号针头、10ml 注射器及 9 号针头、1ml 和 2ml 吸管、酒精棉球、碘酒棉球、生理盐水、大小镊子、外科剪、鼠解剖板、试管架、10 或 20ml 试管或试剂瓶。四、方法和步骤1. 测试组的确定 为使效价测定精确，应先将各测试样品浓度组距加大进行粗测，以测得样品较为精确的效价。2. 小白鼠分组 将小白鼠随机分为六组，每组 10 只，分别编号。其中一组为对照。其余小鼠为备用。根据学生人数分成相应的组进行实验。3. PMSG 的稀释 用生理盐水先将 PMSG 制剂稀释 20 倍，作为工作液。然后再用生理盐水将工作液稀释成含 PMSG 不同的浓度组（附表 1） 。该浓
44、度是根据预测样品中激素效价的大致范围而设计的组间距离。194. 注射 每组学生分别就其中一种浓度的 PMSG 给本组的 10 只小鼠进行注射。其中 5 只小鼠做颈背部皮下注射，另外 5 只做腹腔内注射，剂量均为 0.2ml/只。对照组用相同方法注射等量的生理盐水。注射方法：颈部皮下注射法。助手用手指捏住小鼠的头及尾部进行固定。注射者用酒精棉球消毒其颈背部。一只手提起皮肤，另一只手将连在 1ml 注射器上的 4 号针头平行刺入皮下，将针头微向上挑起但不露出针尖，再注入药物。随药物的推入，皮下可见鼓起一个小泡，表明药物注入确实。凡注射部位有外渗的小鼠必须淘汰，换鼠重新注射。腹腔内注射发。操作者一只
45、手固定小鼠，另一只手注射。用酒精棉球消毒腹部，然后在阴部前方平行进针，再与腹中线呈 45 度角刺入腹部，缓缓注入药物，注射后针头应逐步推出。注射完毕，小鼠放置在相同条件下饲养。5. 剖检 注射药物后 7276h，采用颈椎脱臼法处死小白鼠。然后将小鼠固定在解剖板上，用外科剪剪开腹腔。找到子宫，拨开其他器官，直接观察子宫增大情况。也可将子宫卵巢剥离取出，观察子宫增大情况。凡比对照组子宫增大一倍或一倍以上者为阳性反应。并做好记录，记下每组反应的只数。6. 效价确定 某一浓度使 5 只小白鼠子宫为阴性反应时，表明该样品所含的实际效价低于该组的小鼠单位。某一浓度使 5 只小白鼠子宫全部呈阳性反应时，表明
46、该样品所含的实际效价高于该组的小白鼠单位。当阳性反应数递减到只有 3 只小白鼠的一组，定位最低有效浓度组。将该组稀释浓度的分母乘以 5（因为每只小白鼠注射 0.2ml，计算 1ml 样品中的小白鼠单位即乘以 5） ，其乘积即为待测 PMSG 的活性效价，以 MU/ml 表示。五、实验注意事项1. 进行生物测定时，应选纯系小白鼠（至少为纯种小白鼠） 。2. 剂量要准确。稀释时一定要摇匀。3. 所用试管。鼠笼需及时作好标记。4. 对照组小白鼠子宫粗细不一时，应选择平均粗细的子宫进行比较。5. 按要求进行小白鼠的饲养管理。六、作业根据解剖结果，计算出测定样品中没毫升所含的 PMSG 小白鼠单位。20
47、附表 1 PMSG 稀释浓度换算小白鼠单位表组别 每毫升 PMSG 工作液加入生理盐水量（ml）稀释后PMSG 浓度注射量（ml/ 只） PMSG 的小白鼠单位（MU/ml）12345对照79101113生理盐水1/1601/2001/2201/2401/2800.20.20.20.20.20.28001000110012001400附表 2 孕马血清稀释倍数换算小白鼠单位表组别 每 0.1ml 血清中加入生理盐水量（ml）稀释后 PMSG浓度注射量（ml/只） PMSG 的小白鼠单位（MU/ml）123456789101.11.51.92.32.73.13.33.94.34.71/121/1
48、61/201/241/281/321/361/401/441/480.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2608010012014016018020022024021选做实验二 小鼠超数排卵及早期胚胎的质量鉴定一、 目的和要求通过实验及操作，使学生了解孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）对卵巢机能的生理作用，掌握超数排卵方法和早期胚胎的质量鉴定，充分认识正常与异常胚胎的形态结构及等级划分标准，为大家超数排卵和胚胎移植打下良好的基础。二、 材料1. 实验动物：56 周龄昆明白系雌性小鼠为超数排卵的供体，成年同系公鼠与之 11 配比。2. 药物与试剂：P
49、MSG、hCG、75%酒精、冲胚液（mPBS） 、矿物油。3. 器材：一次性 1mL 注射器、镊子、剪刀、表面皿、巴氏吸管、直径为 35mm 的培养皿、实体显微镜等。三、 超数排卵方法及胚胎采集取 56 周龄昆明白系雌性小鼠，间隔 48h 分别腹腔注射 10IU PMSG 和 hCG，hCG 注射后与性成熟公鼠合笼，次日检查阴道栓，有栓雌鼠在注射 hCG 后 7884h 处死、摘取子宫，在实体显微镜下，用含有 mPBS 液的 1mL 注射器将子宫置于表面皿中冲洗 3 遍，以回收桑葚胚及早期囊胚。操作液和胚胎置于 37恒温台上保存。四、 胚胎质量鉴定将回收的胚胎用 mPBS 洗净后，移入新鲜的覆盖有矿物油的 100L mPBS 液滴中，在410 倍以上实体显微镜下进行胚胎质量鉴定。（一） 胚胎的级别划分目前对胚胎的质量鉴定基本上采用形
