1、实验二 药物血浆蛋白结合率测定前 言：药物血浆蛋白结合率是药物与血浆蛋白结合的量占药物总浓度的百分率，是药物代谢动力学的重要参数之一。它影响药物在体内的分布、代谢与排泄，从而影响其作用强度和时间，并往往与药物的相互作用及作用机制等密切相关。研究药物血浆蛋白结合率的方法包括常规的平衡透析法、超滤法、超速离心法、凝胶过滤法、分配平衡法、稳定同位素-GC-MS 法、光谱技术等。本实验主要通过采用平衡透析法对药物血浆蛋白结合率进行测定，对于新药研究开发和指导临床合理用药都具有重要意义。关键词：血浆蛋白结合率 平衡透析法 磺胺嘧啶【实验原理】平衡透析法的基本原理是将蛋白置于一个隔室内，用半透膜将此隔室与
2、另一隔室隔开。蛋白等大分子不能通过此半透膜，但系统中游离配基可自由通过。当达到平衡时半透膜两侧自由配基的浓度相等。若系统中自由配基的总量已知，测定不含蛋白隔室中自由配基的浓度，即可推算与蛋白结合的配基量。再用重氮化偶合比色测定法对磺胺药的含量进行测定。其测定原理是具有游离氨基的磺胺药在酸性介质中重氮化后，可与 N-(1 萘基）乙二胺产生偶合反应生成紫红色偶氮染料，再与同样处理的磺胺药标准液比较，即可求得剩余的亚硝酸影响测定，用氨基磺酸胺分解除去。【材料与试剂】1. 药物 10%磺胺嘧啶钠注射液2. 试剂15%三氯醋酸溶液 0.1%亚硝酸钠溶液 0.5%氨基磺酸胺溶液0.1%二盐酸 N-（1 萘
3、基） -乙二胺溶液 磺胺嘧啶钠贮存标准液磺胺嘧啶钠应用标准液(3.75ug/ml)3. 透析液pH7.4 的 0.02M 磷酸盐缓冲液，内含 0.15M NaCl4. 鸡、兔各 3 只5. 管状半透膜 周长 5cm，长约 12cm【试剂的配制】1. 0.1%二盐酸 N-（1 萘基） -乙二胺溶液 0.5 g 溶于 95 %乙醇约 400 mL 中，再 用乙醇稀释至 500ml，棕色瓶于冰箱中保存2. 贮存标准液 取标准品 0.125g 溶于蒸馏水中，并稀释至 1000mL。如不溶于水，可先溶于0.1 mol/L 氢氧化钠 25mL 中，再加 4mol/L 硫酸 175 mL，用蒸馏水稀释至10
4、00mL。3. 应用标准液 精确吸取贮存标准液 3mL，置 100 mL 容量瓶中，用 3%三氯醋酸稀释至刻度。(本实验是用 10%磺胺嘧啶钠注射液进行标准液的配制：即吸取 3.75ul 的 10%磺胺嘧啶钠注射液置于 100 mL 容量瓶中，用 3%三氯醋酸稀释至刻度。)【操作步骤】1. 血浆的制备：兔心脏采血，鸡翼静脉采血，肝素抗凝，以 3000rpm 离心10min，上清液即为血浆。 2. 将管状半透膜一端折叠，用纱线扎紧，保留结扎线段 10cm 左右，以调节袋内 外液面在同一水平，加血浆样品 2.0ml 于上述半透膜袋内，并扎紧口袋另一端。注意：袋口不得污染血浆。3. 将两端扎紧的半透
5、膜置于盛有 9.75ml 透析液的 30ml 广口瓶中，用袋两端线段调节袋内外液面4. 加 2.0ml 透析液代替血浆于半透膜袋内，作平衡时间对照样品，以确定药物从袋内外自由扩散达到平衡所需时间。5. 加所试磺胺药溶液 0.25ml 于各瓶袋外透析液中。注意：容积越小越好，以免影响透析液的组成6. 置广口瓶于冰箱中，平衡透析时间约需 60h 左右。7. 待透析平衡后，吸出袋外透析液少许，加等量磺基水杨酸试剂，检查有无血浆蛋白漏出。如检查为阳性，则该样品作废。8. 取出半透膜，用滤纸吸干袋外壁透析液，小心解开透析袋，使袋内血浆流入干净试管。9. 用重氮化-偶合比色法测定袋内外溶液中磺胺药浓度1）
6、取袋内外溶液各 0.5ml，加水 15.5ml；加 15%三氯醋酸 4ml，混匀，静置2min，过滤。取试管 3 支，各加入滤液 5mL，为测定管。取试管 3 支，加入空白对照液 5mL，为空白管。取试管 3 支，加入应用标准液 5mL，为标准管。2）在以上各管中各加入 0.1%亚硝酸钠溶液 0.5mL，混匀，放置 3min。3）各加入 0.5%氨基磺酸胺溶液 0.5mL，混匀，放置 2min。4） 各加入 0.1%二盐酸 N-（1 萘基）-乙二胺溶液 2.5mL，充分混匀，放置10min。5）用 721 分光光度计在 550nm 波长处比色以空白管校正光密度到 0 点，读取标准管和测定管光密
7、度，计算游离磺胺 药物含量10. 计算血浆蛋白结合率计算公式测定管光密度游离磺胺药含量（mg%）= 应用标准液浓度 样品稀释倍数标准管光密度%10Dtffbfb：血浆蛋白结合率；Dt：血药总浓度（透析袋内血浆药物浓度） ；Df：游离药物浓度（透析袋外缓冲液中药)；【实验结果与分析】1.由于实验过程中鸡和兔的采血量分别有限，所以每人只做了一种血样。本人开始做的是兔的血样，磺胺药物浓度为 0.025M，但在透析平衡后，吸出袋外透析液少许，加等量磺基水杨酸试剂，检查有白色沉淀析出，则说明有血浆蛋白漏出，所以该样品作废。分析原因有以下几点：1）装透析液的广口瓶不干净，造成污染。2）用于给袋外透析液加入
8、磺胺药溶液的注射器不干净，前面实验可能吸入过血样，造成后面的蛋白沉淀。3）在打开半透膜的过程中，对膜内侧造成了污染。2.由于第四组多了一个药物浓度为 0.00625M 的鸡的血样，所以透析平衡后的实验步骤就做的是这个样品的。实验结果如下：1）经测定，a.标准管光密度为 0.415；b.测定管光密度（半透膜内溶液）三次平行分别为 0.008、0.005、0.008 则,测定 管光密度（内）为 0.008+0.005+0.008/3=0.007；c.测定管光密度（膜外溶液）三次平行分别为 0.003、0.003、0.004，则测定管光密度（外）为 0.003+0.003+0.004/3=0.003
9、3；d.应用标准液浓度为 3.75ug/ml，换算成 0.375mg/100ml；e.样品稀释倍数为 40 倍。2）则计算结果如下： 0.007膜内磺胺药含量（mg%）= 0.375mg/100ml40= 0.253%; 0.415 0.0033膜外游离磺胺药含量（mg%）= 0.375mg/100ml40= 0.119%；0.4150.253%0.119%= 100%=52.96%;%10Dtffb0.253%【讨论】该实验采用平衡透析法进行测定，平衡透析法基于药物结合的平衡原理，是测定药物游离浓度最常用的方法。该法具有简单、经济、受实验因素的干扰小等优点，是研究药物血浆蛋白结合率的经典方法
10、，但该法也存在一定的缺点：1) 透析平衡时间较长；2 ) 血浆和缓冲液的 PH 值以及离子强度必须严格控制；3）受稀释作用以及体积迁移效应的影响；4）非特异性的透析设备表面的药物吸附效应。同时，实验温度影响也很大，一般都在 37 度,空气浴中震荡加速平衡。如果药物不稳定，可以采用低温或加入适量的稳定剂。透析时间的确定，可以做对照实验，用血浆代替同体积的缓冲液,测定袋内外达平衡时的时间。但是该实验的最终结果测出的结合率偏大，在实验过程中可能有以上分析的原因造成的误差，同时，在实验过程中应该注意以下几点：1）采血过程中注意抗凝的处理；2）实验过程中注意每个仪器的清洁问题，以免造成污染；3）用线扎半透膜的时候注意两头扎紧，以免膜内溶液外泄；4）在将半透膜浸入透析液的时候注意将膜内空气排净，以免在浸入时候导致膜内溶液不能完全浸入透析液中，造成实验误差；5）在配制药物过程中浓度一定要计算准确，严格按照操作步骤进行。
