1、微生物学实验七 平板菌落计数与接种一、目的要求 学习平板菌落计数的基本原理和方法 练习微生物接种和培养的基本技术，掌握无菌操作技术二、实验原理将待测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已趋向使用菌落形成单位(cfu)，而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。三、实验材料 样品：取土 试剂和仪器： 无菌水、无菌培养皿、无菌吸管、记号笔、接种环、接种针、酒精灯、标
2、签纸、水浴锅 2 人/组：稀释平板计数用：6 只平皿、2 根三角玻棒、 2 支装 9ml 无菌水的试管、 4 根无菌吸管、牛肉膏培养基；接种用： 2 支液体牛肉膏蛋白胨培养基、2 支半固体牛肉膏蛋白胨培养基、2 支黄豆饼粉固体斜面培养基。四、实验过程（一）稀释平板菌落计数1、 编号与稀释:每组取无菌平皿 6 只，一个稀释度做 3 只。标明 104 和105 各 3 只。2、制备土壤稀释液：称取土壤 10g，制备 101 土壤稀释液，再取 4 只 无菌试管稀释制备 104 、105 菌液。3、倒平皿与平板涂布：取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿中，冷却凝固。分别吸取 0.1 ml 上述制备的
3、 104 或 105 菌液玻棒涂布，室温静置 510 min，使菌液吸附进培养基，倒置于 37 0C 恒温培养 24 h。 4、观察细菌菌落形态以及计数菌落：培养 24 h 后，取出培养皿数菌落数，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每 ml 中菌落形成单位（cfu）同一稀释度三次重复的平均菌落数稀释倍数105、计算出每 g 土壤中细菌的数量：即用某一培养皿内细菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。（二）微生物的接种 接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。 接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接
4、种锄、玻璃涂棒等。（1）斜面接种法（1 支试管/人）使用黄豆饼粉斜面培养基，用接种环从平皿上挑取放线菌或霉菌单菌落。 左手平托两支试管，拇指按住试管底部。外侧使是菌种试管，内侧是待接的空白斜面。 （两支试管的斜面同时向上） ，右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。 右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。 将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指和掌心将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓过火焰。 将已灼烧过的接种环伸入外侧的菌种试管内。先冷却，而后再用环沾取一定量的菌苔，将沾有菌苔的接种环抽出试管。 迅速将沾有菌种的接种环伸
5、入另一支待接斜面试管的底部，轻轻向上划线（直线或曲线） 。 接好种的斜面试管口再次过火焰，棉塞底部过火焰后立即塞入试管内。 将沾有菌苔的接种环在火焰上烧红灭菌。先在内焰中烧灼，使其干燥后，再在外焰中烧红，以免菌苔骤热，使菌体爆溅，造成污染。 放下环后，再将棉塞旋紧，在试管斜面上距试管口 23cm 处贴上标签。 280C 恒温培养。（2）液体接种法（1 支试管/人）使用牛肉膏蛋白胨液体培养基。用接种环从平皿上挑取细菌单菌落，接入液体培养基。 放下环后，再将棉塞旋紧，在试管斜面上距试管口 23cm 处贴上标签。 37 0C 恒温培养。（在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种，同时要求无菌
6、操作。）（3）穿刺接种（1 支试管/人）使用牛肉膏蛋白胨半固体培养基。用接种针从平皿上挑取细菌单菌落，接入半固体培养基。 用接种针经火焰灭菌后，沾取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后沿着原接种线将针拔出，要做到手稳、动作轻巧迅速，最后塞上棉塞。再将接种针上残留的菌体在火焰上烧掉。 在试管斜面上距试管口 23cm 处贴上标签。 37 0C 恒温培养。五、实验任务1、2 人一组: 6 只平皿稀释平板计数，做 2 个稀释度。 24 h 观察并计数。2、每人：做 1 支斜面接种（接放线菌或霉菌） ，1 支液体接种（接细菌） ，1 支半固体穿刺接种（接细菌） 。六、思 考 题1. 结果（1）将培养后菌落计数情况填如下表： 2. 为什么融化后的培养基要冷却至 45 0C 左右才能倒平板？3. 要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？
