1、实验一 食品中细菌总数的检验 一、实验目的要求1、 了解细菌总数检验的意义。2、 掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法3、 掌握国标法测定菌落总数的方法和技能4、 熟练无菌操作技术。二、原理菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得 1g 或 1ml 检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。三、试剂和仪器（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称
2、 数量 用途1、500ml 广口瓶 1 个 稀释样品2、500ml 三角瓶 1 个 配制生理盐水3、250ml 三角瓶 2 个 配制营养琼脂4、18180mm 试管 3 支 稀释样品5、1ml 移液管 5 支6、直径为 90mm 平皿 10 套 倒营养平板7、250ml 量筒 1 支8、玻璃珠：直径约 5mm（二）应灭菌、消毒的器材剪刀 1 把 不锈钢药匙 1 把 称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球 1 个，滴管胶头 4 只， 开瓶器（三）应制备的培养基培养基总量 所用容器1、 0.85%NaCl 生理盐水 1 瓶 300ml/瓶 500ml 三角瓶2、 平板计数琼脂（PCA）培养基： 2 瓶
3、 100ml/瓶 250ml 三角瓶四、实验内容（一） 、基本操作过程：样品称量样品稀释倾注平皿培养 48 小时计数报告。（二） 、样品的稀释（样品的处理）样品：袋装乳粉外包装消毒无菌称样品 25g加无菌生理盐水加盖振荡摇均匀1、用 75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称取检样 25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中，然后用 225mL 温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先加入少量生理盐水将乳粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结团），采用振摇法（用力快速振摇 50次,振幅不小于 40cm）振摇均匀，即为 1:10 的稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以 80001000
4、0r/min 的速度处理 1min，制成 1：10 的均匀稀释液。2、用 1ml 灭菌吸管，吸取 110 稀释液 1ml，注入含有 9ml 灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成 1100 稀释液。3、另取 1ml 灭菌吸管，按上项操作顺序作 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支 1ml 灭菌吸管。4、根据对检样污染情况的估计，选择 23 个适宜稀释度，分别在作 10 倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的稀释液 1ml 于灭菌平皿内，每个稀释度做 2 个平皿。5、用 1ml 生理盐水作空白对照试验，做 2 个平皿。 注意：吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀
5、释液。吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达 2.5cm 以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。进行稀释时，应使吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。每递增稀释一次，即换用一支 1ml 灭菌吸管。（三） 、倒平板稀释液移入平皿后，应及时将凉至 46的营养琼脂培养基（放置于 46水浴保温）倾注入平皿约 15ml，并转动平皿使混合均匀。 注意：培养基不能触及平皿口边沿，加入培养基后可正反两个方向旋转，但不可用力过度，以免溅起触及上盖。检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜超过 20min。（四） 、培养待琼胶凝固后，翻转平皿，置 361温箱内培养 48h 后取出，立即计算平皿内菌落数
6、目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 注意：（1） 琼脂凝固后，就立即将平板放入培养箱内进行培养，以免细菌蔓延生长。（2） 如果把不能立即计数，要将平板放入 04冰箱中，但不能超过 24 h。 不同产品菌落总数测定的培养时间：肉、乳、蛋及制品： 37培养 48h水产品： 30培养 48h：清凉饮料、调味品、糕点、果脯、酒类等：37培养 24h五、结果报告1、 平皿菌落数的选择（1）选取菌落数在 30300 之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿，大于 300 的可记为多不可计。（2）其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作
7、为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平板后乘以 2，以代表一个平板的菌落数。（3）当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。 2、菌落总数的计算（1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）中菌落总数结果。（2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按如下公式计算：N=C/（n1+0.1n2）d（1 ) 式中：N 样品
8、中菌落数；C 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；nl 第一个适宜稀释度平板数；n2 第二个适宜稀释度平板数；d 稀释因子（第一稀释度） 。（3）若所有稀释度的平板菌落数均300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 （4）若所有稀释度平板菌落数均300，有的又30，则应以最接近 300或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 3、报告方法（1）菌落数在 1100 时，按四舍五入报告两位有效数字。（2）菌落数 100 时，第三位数字按四舍五入计算，取前面两位有效数字，为了缩短数字后面的零数，也可以 10 的指数表示。（3）若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。（4）若
9、空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。（5）称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。 计数下表中的数值：稀释度及菌落数10-1 10-2 10-3菌落总数/cfu/g（mL ）报告方式/cfu/g（mL ）实验二 食品中霉菌和酵母菌的检验一、实验目的要求1、掌握测定霉菌和酵母菌的方法和技能2、熟练无菌操作技术。二、原理酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不
10、强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是 pH 低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等 。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等 。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标
11、准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。三、试剂和仪器（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称 数量 用途1、500ml 广口瓶 1 个 稀释样品2、500ml 三角瓶 1 个 配制生理盐水3、250ml 三角瓶 2 个 配制营养琼脂4、18180mm 试管 3 支 稀释样品5、1ml 移液管 支6、10ml 移液管 1 支6、直径为 90mm 平皿 10 套 倒平板7、250ml 量筒 1 支8、玻璃珠：直径约 5mm 适量（二）应灭菌消毒的器材剪刀 1 把 不锈钢药匙 1 把 称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球 1 个，滴管胶头 4 只（三）应制备的培养基培养基总量
12、所用容器1. 灭菌蒸馏水： 1 瓶 300ml/瓶 500ml 三角瓶2. 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA ）： 2 瓶 120ml/瓶 250ml 三角瓶四、实验内容（一） 、基本操作过程：样品称量样品的稀释倾注平皿培养 5 天计数报告。（二） 、样品的稀释（样品的处理）样品：糖果用灭菌镊子夹取包装纸,称取数块共 25g，加入预温至 45的灭菌水 225mL，待溶化后检验。1、用 75%酒精棉球擦拭消毒袋口，以无菌操作开封取样。称取检样 25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中。然后加入 225mL 的灭菌水，采用振摇法（用力快速振摇 50次,振幅不小于 40cm）振摇 30 min，
13、振摇均匀，即为 1:10 的稀释液。2、用 10ml 灭菌吸管，吸取 110 稀释液 10ml，注入无菌试管内，另用带橡皮乳头的 1ml 灭菌吸管反复吹吸 50 次，使霉菌孢子充分散开。3、用 1ml 灭菌吸管，吸取上述 110 稀释液 1ml，注入含有 9ml 灭菌水的试管内，换一支 1ml 灭菌吸管反复吹吸 5 次，制成 1100 稀释液。4、另取 1ml 灭菌吸管，吸取上述 1100 稀释液 1ml，注入含有 9ml 灭水的试管内，按上项操作顺序作 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支 1ml 灭菌吸管。5、根据对检样污染的情况估计，选择 3 个适宜稀释度，分别在作 10
14、 倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的 1ml 稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做 2 个平皿。6、用 1ml 无菌水作空白对照试验，做 2 个平皿。 注意：加入检样液时，吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液，并将吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达 2.5cm 以上 ,调整时应使管尖与容器内紧贴。每递增稀释一次，即换用另一支 1ml 灭菌吸管。（三） 、倒平板稀释液移入平皿后，及时将凉至 46的培养基（可放置于 46水浴保温）倾注入平皿约 15ml，并正反转动平皿使混合均匀。 注意：培养基不能触及平皿口边沿，加入培养基后可正反两
15、个方向旋转，但不可用力过度，以免溅起触及上盖。检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜过长。（四） 、培养：待琼脂凝固后，翻转平皿，置 2528温箱内培养 5 天，从第 3 天开始观察后取出，共观察培养 5 天。五、菌落计数及报告：选取菌落数在 10 CFU150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。1）计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。2）若所有平板上菌落数均大于 150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。3）若所有平板上菌落数均小于 10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。4）若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于 1 计数。五、结果报告样品10-1 10-2 10-3稀释度及菌落数样品10-1 10-2 10-3菌落总数/cfu/g（ mL）报告方式/cfu/g（mL） 鲜豆腐豆腐干豆奶
