1、1目 录实验一 植物细胞的观测4实验二 植物液泡的观察6实验三 用染色法测定原生质的等电点6实验四 原生质运动的观察8实验五 细胞质壁分离法测定植物组织渗透势9实验六 叶绿体色素及其理化性质10实验七 叶绿体色素的分离纸层析法12实验八 叶绿素的定量测定12实验九 植物光合强度的测定改良半叶法13实验十 植物呼吸强度的测定14实验十一 离体线粒体的氧化作用和磷酸化作用15实验十二 植物呼吸酶的简易鉴定法17实验十三 植物组织水势的测定小液流法19实验十四 植物伤流液的成份分析20实验十五 植物根系对矿质元素的选择吸收22实验十六 单盐毒害与混合盐的拮抗作用23实验十七 植物的溶液培养与矿质元素
2、缺乏症23实验十八 硝酸还原酶活性的测定25实验十九 根系活力的测定（TTC 法）26实验二十 种子生活力的快速测定27实验二十一 植物生长区域的测定292实验二十二 生长素类物质对根芽生长的影响31实验二十三 生长素的生理效应及生物鉴定法32实验二十四 用水稻幼苗法测定赤霉素类物质的浓度33实验二十五 赤霉素对 淀粉酶的诱导形成35实验二十六 细胞分裂素的保绿与阻止衰老的作用36实验二十七 细胞分裂素对菜豆叶片生长和衰老的效应37实验二十八 用棉花幼苗外植体测定脱落酸的活性38实验二十九 用萝卜子叶增重法测定细胞分裂素类物质的浓度或效价39实验三十 乙烯的生物测定黄化豌豆幼苗的“三重反应”
3、40实验三十一乙烯的催熟作用和对性别分化的影响41实验三十二 生长素和乙烯对叶片脱落的效应43实验三十三 开花刺激物在短日植物中通过嫁接的传递44实验三十四 花粉管的生长及其向化性46实验三十五 不良环境对植物的伤害47实验三十六 植物体内游离脯氨酸的测定48实验三十七 根际 pH 的显色测定 49实验三十八 钾离子对气孔开度的影响 49实验三十九 希尔反应的观察 50 实验四十 植物离体叶片失水表型观察及其失水率测定 513植物生理学实验规则植物生理学实验的目的在于配合课堂教学，验证理论内容，并在实验过程中学习有关作物的植物生理学方面的实验室技术操作及一些田间应用方法，从而能够初步熟悉科学研
4、究方法，分析实验结果并作出正确结论。因此，学生应以认真的态度，科学的精神从事本课程的实验。1学生在实验前，必须仔细阅读实验指导，以便了解每次实验的目的与要求以及主要的实验操作过程。教师得向学生查问，以了解学生的准备情况。2实验时，教师讲解当日实验的要点及操作中的注意事项，学生必须认真听讲。3学生两人一组进行实验。要求两人共同进行实验操作，如有必要分工，亦必须密切配合。4公用药品必须在原来放置的地方使用，公用仪器用毕后应立即送达到原处。仪器与药品应注意爱护和节约，以免造成浪费或损失。所用仪器或玻璃器皿如有损坏应立即报告教师，酌情按价赔偿，贵重仪器使用时应由教师在旁指导。每次实验结束后，应将所用玻
5、璃器皿洗净收好，并将实验台整理清洁。5每个实验均应仔细观察、测定，将所得结果绘图，列表或将数据绘成曲线，仔细记录在报告本内，并将所得结果加以分析，写出结论。实验指导中所列问题均应在报告里回答，实验报告应按教师指定时间完成上交。二 00 七年修改4实验一 植物细胞的观测一、植物细胞的活体染色及死活鉴定原理活体染色是介于活观察和固定、切片染色之间的一种方法，是选用某些无毒或毒性较小的染色剂，显示出细胞内某些构造的存在，而不影响细胞的生命活动也不产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡的方法。中性红是常用的活性染料之一，又是一种 pH 指示剂，变色范围在 pH6.4-8.0 之间（由红变黄） ，在酸性
6、条件下中性红的解离度很强，带色的阳离子呈樱桃红色，在 pH7 以上，它不解离而以分子态溶解于水呈橙黄色的溶液。中性红的分子式为：生活的植物细胞，其含水分的纤维素细胞壁上往往有羟基，泡液呈酸性。如果用低于泡液 pH 的缓冲液配制的中性红溶液进行活染时，由于中性红在介质中已成解离态，其带色的阳离子易被吸附在细胞壁上使壁显红色，而生活原生质和液泡均无色；如果在中性或微碱性的液体环境中，中性红分子便有进入液泡并呈解离形式的趋势，当中性红分子进入偏酸的泡液处，解离出带色的阳离子而呈玫瑰红色，累积在液泡里，这时液泡显色而原生质和细胞壁不着色；如果是死细胞，原生质体凝固并丧失半透性，桔红色的中性红分子被吸附
7、在原生质表面，表现为细胞核和细胞质着色，而液泡不着色。可根据这些现象鉴定细胞死活。材料与设备洋葱鳞茎、大葱叶基部分、小麦叶片等显微镜一台、小培养皿一套、载玻片和盖玻片各 2 片、刀片 1 片、尖头镊子、粗滤纸和火柴（以一组为单位）药品0.03中性红溶液：0.3g 中性红溶于 1000ml 蒸馏水中。实验步骤1取洋葱的内层幼嫩鳞片，用刀片在鳞片内侧纵横切割成 0.5cm2 的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，置于载玻片上，滴加清水后盖上盖玻片，在较暗的视野下进行镜检。仔细辨认成熟细胞的各个部分：透明而界限清晰的细胞壁。有颗粒状结构的原生质。含有泡液的液泡。若用小麦叶片为材料时，可采 1 片叶
8、片，将叶背面朝上平铺在载玻片上，再将此载玻片放入盛有少量清水的培养皿内，用左手将叶片按平，右手用刀片从一个方向轻轻刮去下表皮和叶肉部分，只留下透明的一层上表皮细胞，然后将其切成约 1cm2的小块。2将制成的表皮小块放入盛有 0.03中性红溶液的小培养皿中染色 510 分钟，然后取出浸入自来水中漂洗 10 分钟，选其中染色均匀的材料小块进行镜检，仔细观察经活体染色后的细胞各部分：液泡部分（稍有收缩）被中性红染成均匀的玫瑰红色。原生质及细胞壁仍为透明无色。这是由于自来水呈中偏碱性。3将用中性红染色后的材料小块取出用蒸馏水漂洗后，在显微镜下观察，由于蒸馏水偏酸性，当进行染色后的活细胞用蒸馏水漂洗时，
9、解离的中性红带色阳离子便吸附在细胞壁的0H 上，因此细胞壁呈现红色而原生质体和液泡均不着色。4在上述制片中寻找个别死细胞，可见原生质体被染成不均匀的橙黄色，另取制片放在载玻片上5在酒精灯火焰上微微加热使细胞致死，在显微镜下观察可见死细胞内原生质体凝结成不均匀的凝胶状，它与细胞核均被染成桔红色。二、质壁分离及质壁分离复原原理生活细胞的原生质体及质膜具有半透性，细胞内部还包含着一个大液泡，它具有一定的渗透势。当细胞与外界高渗溶液接触时，细胞内的水分外渗，原生质体随液泡一起收缩而脱离了细胞壁发生分离现象；当细胞与低渗溶液接触时，细胞吸水发生质壁分离复原。死细胞没有这种现象，因此，可利用质壁分离及质壁
10、分离复原现象来鉴定细胞死活。植物细胞的质壁分离可有多种形式，如凸形、帽形等，如图 1所示。质壁分离形式的不同往往与原生质的粘性有关，凡是原生质粘度大的，能维持较长时间的凹形，甚至成为痉挛形；原生质粘度小的，较快形成凸状质壁分离。Ca +能降低原生质胶体的水合度，即可增高原生质的粘性；而 K+则相反，它能提高原生质胶体的水合度，降低原生质的粘性。所以，经 Ca+处理后，原生质发生凹形质壁分离，而经 K+处理则发生凸质壁分离。当用 KNO3的高渗溶液进行长时间质壁分离时，由于原生质水合度大大增加，原生质层变，似帽状包围在收缩的液泡两端，称为帽状质壁分离。材料与设备洋葱鳞茎、大葱叶基部分、小麦叶片等
11、显微镜一台、小培养皿一套、载玻片和盖玻片各 2 片、刀片 1 片、尖头镊子、粗滤纸和火柴（以一组为单位）药品：1M 蔗糖溶液；0.02MCaCI 2 溶液；0.03MKCI 溶液。实验步骤1同上实验制取活染制片，在显微镜下确定活细胞的欲测视野后，在载玻片的一端轻轻滴加一滴 1M 蔗糖溶液，在载玻片的另一端用滤纸条吸引以使糖液引浸到全部制片上。处理的同时在镜下注意观 察生活细胞发生质壁分离时其内部的变化：整个细胞首先发生轻微均匀地收缩，随着胞壁松驰，原生质逐渐自细胞角隅处脱离壁发生“初始质壁分离”现象。注意在原生质收缩的同时，有很多被撕扯的原生质丝（称 Hecht 线）仍将“质”与“壁”连系着，
12、这表明生活原生质体本是紧贴着细胞壁的，由于细胞脱水，原生质也随着发生不均匀的收缩，使原生质细丝残留下来。2在制片一端滴加清水，在另一端用滤纸将水吸引到全部制片上，细胞观察质壁分离复原现象。3取实验一制备活染制片，然后将制片分别浸入 0.02M 的 CaCl2 与 0.03M 的 KCI 溶液内，浸泡2024 小时后，取出置于载玻片上，盖上盖片，再滴加 1M 的蔗糖溶液使之发生质壁分离，仔细观察质壁分离的不同形式。若轻轻挤压已发生质壁分离的细胞，由于液泡破裂，有中性红着色的泡液流出，中性红遇 K+或Ca+后立即形成暗红色小颗粒，布满整个细胞腔。生活无损的细胞则无此现象。思考题1根据实验结果，说明
13、活细胞与死细胞原生质性质有哪些不同？如何加以区别？2在用中性红活染时，用自来水（pH7 以上）冲洗浸泡与用蒸馏水（pH7 以下）效果有何不同？图 1 不同形式的质壁分离1凹形质壁分离 2.凸形质壁分离 3.帽形质壁分离：（1）细胞核；（2）膨胀的原生质；（3）液泡（1）（2）（3）1 236为什么？3死细胞为什么不能发生质壁分离及质壁分离复原？实验二 植物液泡的观察一、小麦幼根中液泡的形成材料和设备萌发的小麦胚根、显微镜、载片、盖片、镊子、滴管、刀片、0.03中性红溶液、小培养皿。实验步骤切取萌发小麦胚根尖端（约距尖端 1cm 左右） ，浸入中性红溶液中进行活染 1015 分钟，然后取出用自来
14、水冲洗 510 分钟，撕取表皮（或作断根纵剖面）于显微镜下进行镜检。可见：在分生区胚性细胞里有少量零星的小红点，表示液泡已开始形成；进入伸长期的细胞内有红色网状交错的液泡结构；在成熟段的细胞里，则有一个很完整的大型液泡，一般位于细胞的中央。二、液泡的分离材料与设备紫洋葱、紫萝卜叶、0.5M 蔗糖溶液、小镊子实验步骤撕取紫色洋葱或萝卜叶片表皮，置于载玻片上，稍滴加清水后盖上盖玻片，于显微镜下观察制片中的细胞，若细胞其中有一个完整无缺的、含花青素的玫瑰紫色液泡，则用滤纸条 吸引液体的方法连续滴加 0.5M 蔗糖溶液，使细胞发生强烈的质壁分离，随后用锋利刀片在细胞纵轴垂直的面上截断，在显微镜下选择已
15、剖开但原生质未受损伤的细胞处，再滴加少许蔗溏液，用小镊子轻轻压盖玻片，可见原生质破裂或脱离，而含有花青素的液泡被完整地游离出来。思考题1 试述植物液泡的结构与功能。实验三 用染色法测定原生质的等电点原理原生质的主要组成物质蛋白质为两性化合物，它在不同 pH 的介质中，其解离情况不同：（1）在酸性介质中：NH 3 NH3+RCH +H+ RCHCOO COOH（2）在碱性介质中：NH 3 NH2RCH +OH RCH +H 2OCOO COO当介质的 pH 值愈小时，此物质的解离就趋向于（ 1）式，反之则趋向于（2）式，若在某一 pH 值下，此物质的解离程度达到平衡，这些外界介质的 pH 即为此
16、物的等电点。7不同的植物组织，由于它们原生质不尽相同，所以具有不同的等电点。欲测植物细胞或组织的等电点，可采用染色法进行。一般采用酸碱性不同的染料作为指示剂，常用的酸性染料有苯胺红、曙红等，这些染料的有色部分为阴离子；碱性染料有亚甲兰，靛兰等，亚甲兰（Methylene blue）分子式为：它的有色部分为阳离子。将待测的植物组织放入苯胺红和亚甲兰的混合溶液中，当介质的 pH 值低于组织的等电点时，带正电荷的原生质便吸附酸性染料的有色部分而显玫瑰红色；当介质的 pH 值高于组织的等电点时，带负电荷的原生质便吸附碱性染料的有色部分而呈兰色；当介质的 pH 值与组织的等电点相等时，原生质的着色反应为
17、红与兰的混合色紫色。植物组织的等电点并不固定在一个数值上，而是具有一定范围，常把这个范围称为植物组织的“等电区” 。本实验则是根据上述原理测定植物组织的等电点。材料与设备四季豆黄化幼苗，蚕豆幼苗5ml 及 1ml 移液管、刀片、小培养皿、小烧杯、毛笔、镊子、粗滤纸0.1M 柠檬酸溶液、0.2M Na 2HPO4溶液、0.1苯胺红溶液、0.1亚甲兰溶液实验步骤1依下表配制不同 pH 的缓冲液，用不同 pH 的缓冲液按以下比例配制 5ml 混合染料，4ml 缓冲液+0.5ml 0.1苯胺红+0.5ml 0.1亚甲兰溶液，分别盛在小培养皿中。pH 0.2MNa2HPO4（ml ） 0.1M 柠檬酸（
18、ml）2.23.03.65.06.07.00.202.053.225.156.318.239.807.956.784.853.691.772取四季豆幼苗胚茎小段，作徒手切片 36 片用 70酒精固定 5 分钟，然后分别取出 6 片放入各个缓冲液的混合染料中染色 2030 分钟。倾去染料，立即加入相应 pH 的缓冲液 5ml，浸泡（以浸没组织为限） ，一小时后，观察各个缓冲液中的制片颜色的变化。取在等电区附近的制片，在光镜下观察，精确地比较植物组织的等电点。附本实验中的酸性染料亦可采用曙红，若用曙红进行染色时，不必配制不同 pH 值的缓冲液的混合染料，可直接取染色液（浓度有 0.01M）等量混合
19、，进行染色 2030 分钟，然后将切片取出分别浸入相应pH 的缓冲液内浸泡，半小时后，便可以取出切片鉴别组织的等电区。思考题1用染色法测定原生质的等电点的基本依据是什么？2要获得比较准确的结果，在实验中应注意哪些问题？8实验四 原生质运动的观察原理在生活细胞内，原生质的活跃运动现象统称为原生质运动。原生质运动是生活细胞的重要标志之一。原生质可以在细胞内流动，也可以通过胞间连丝穿流于细胞与组织之间，有时并非全部原生质都参与运动而仅限于局部细胞质，往往原生质表面的透明层（Hyaloplasm）处于静止状态。原生质运动在所有生活细胞中均可见，但往往在某些特定材料中表现得特别明显。有时由于在制片时对材
20、料的机械损伤，也会引起原生质发生强烈的运动。原生质运动是生活体消耗能量而做功的生理过程，它与植物体内的物质运输及分配以及多种酶促反应密切联系。原生质运动有各种形式，一般将原生质运动归为两类，凡并非因外界环境的改变而引起的原生质运动，称为自发性的原生质运动；由于某种外界原因而引起的原生质运动称为诱发性的原生质运动。本实验使用光学显微镜观察几种植物细胞原生质的运动现象；测定原生质运动的速度及观察呼吸抑制剂 2，4二硝基酚（DNP ）对原生质运动的影响。材料和设备黑藻、轮藻、小麦幼苗（种子萌发 23 天根长 12cm） 、紫鸭趾草（正在开花的） 、洋葱鳞茎（未萌发的紫皮鳞茎） 、南瓜叶片表皮毛或茎部
21、表皮毛、粘菌的原生质团、显微镜、载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、剪刀、纱布、擦镜纸、目镜测微尺、台尺、秒表、滤纸。5104 M 的 2，4二硝基苯酚溶液实验步骤1观察几种植物细胞的原生质运动现象。黑藻叶片的观察：用镊子取下黑藻幼嫩叶片放于载玻片上，滴加清水并盖上盖玻片，在显微镜下观察，寻找沿叶片中脉的部分，细胞中叶绿体随原生质沿胞壁移动（若室温低于 20或阴天看不见原生质运动现象时，可用强光照射 1520 分钟后再观察） 。注意整个叶片中哪些部分原生质流动得最快，相邻两细胞中流动方向有何不同。轮藻节间细胞的观察，取一株粘藻（含有两个以上的节）节间，用水洗净后置于载玻片上，加盖玻片于显微镜下观察，
22、由于轮藻节间外面常有沉积物附着不易看清，因此可先在低倍物镜下移动载玻片，找到合适的部分后再换高倍物镜观察，细胞中排列整齐的叶绿体并不移动，而原生质透明部分夹带着大小颗粒一起流动，小心地调动细螺旋仔细观察。小麦根毛的观察：将小麦根剪下放在载玻片上，加盖玻片在低倍镜下找到根尖以上的根毛区，然后在高倍镜下进行镜检，可以看到透明原生质夹带一些颗粒沿根毛细胞壁流动，注意根毛尖端和基部原生质流动方向的变化。紫鸭跖草雄蕊毛的观察：将正在开放或即将要开的紫鸭跖草的花剥开，用镊子取下几根雄蕊毛，在显微镜下观察，可见细胞内的原生质以不固定的方向流动。洋葱鳞茎内表皮的观察：用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮，在显微镜下观察，
23、可看到细胞中原生质的运动。轻轻取下南瓜叶片表皮或茎部表皮，置于载玻片上，滴上清水后盖上盖玻片，于镜下进行镜检，可见原生质丝纵横交错地包在表面，原生质的运动可以其中小颗粒的位移作为指标。仔细观察原生质的运动方向及其通过胞间连丝穿流于细胞的情况。观察萌发的花粉管，可见原生质在花粉管中的环流现象。92测定原生质运动的速度可以原生质中某些颗粒的移动速度作指标来测定原生质的运动速度。但原生质颗粒大小不一，它的移动速度亦异，因此应尽量选用较小的颗粒，进行多次测定，求出平均值。先将目镜测微尺装入目镜，将台尺（一小格相当于 0.1mm 即 10m）置于载物台上，求出目镜测微尺每格相当于多少毫米（或微米） ，移
24、去台尺。将植物材料放在显微镜下用同一物镜观察。转动目镜，使其中的测微尺与原生质的流动方向平行，用秒表求出每走若干格（视植物材料而定）所需的时间，测1020 次求出平均值。3呼吸抑制剂 DNP（2，4二硝基酚）对原生质运动的影响原生质运动需要消耗能量，这要靠呼吸作用来提供。DNP 能抑制呼吸过程中磷酸化过程，因而也就抑制了原生质运动。反复将 5104 M 的 DNP 滴加在载玻片的一端，在另一端用滤纸片吸引，1020 分钟后，可见原生质流动减缓甚至停止。实验结果1绘制几种植物细胞原生质运动的简图，并做简要说明。2原生质运动速度的测定：目镜测微尺 格与台尺上 格等长。目镜测微尺每一格有 微米。思考
25、题1DNP 对原生质运动有何影响？为什么？2原生质运动的动力是什么？3常见的原生质运动方式有哪些？试描述特点。实验五 细胞质壁分离法测定植物组织的渗透势原理将植物组织放入一系列浓度递增的蔗糖或甘露醇溶液中，经过一定的时间使达到渗透平衡后，细胞在其中发生临界质壁分离的溶液渗透势即等于细胞液的渗透势。此溶液称为等渗溶液，其浓度称为等渗浓度。实际测定时，根据引起临界质壁分离的溶液浓度与相邻的不引起质壁分离的溶液浓度的平均值，求出等渗浓度，并计算出此溶液的渗透势，即为细胞的渗透势。材料和设备一、植物材料：洋葱鳞茎，紫鸭趾草叶片。二、设备：显微镜、刀片、移液管、直径 6cm 培养皿、镊子。三、试剂：1.
26、00mol 蔗糖溶液或甘露醇溶液。实验步骤1、以 1.00mol 的蔗糖溶液为母液，用蒸馏水稀释成0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60mol 溶液，摇匀后备用。2、用刀片在洋葱鳞茎内表皮上划出边长为 25mm 的小方格，用镊子剥取表皮。注意撕下的表皮的厚度要适当。3、自高浓度的溶液开始，每隔一定时间（如 3min） ，依次向浓度递减的蔗糖溶液中放入 45 片表皮块（表皮撕下立即投入溶液中） ，使表皮完全浸入溶液。15-20min 后，从最高浓度的蔗糖溶液开始，按原来放入的顺序取出表皮；在载玻片上滴 12 滴相应浓度的蔗糖溶液，放显微镜下观察几
27、个视野，记录并计算质壁分离的情况。找出引起 50左右的细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅处与细胞壁分离的蔗糖溶液浓度；以及不足 50%的细胞发生质壁分离或不产生质壁分离的蔗糖的最高浓度。4、重新配制上述结果的两种浓度的蔗糖溶液，用新的表皮重复实验 12 次，直到实验结果符合要求。这两种蔗糖溶液渗透势的平均值即为细胞液的渗透势。10结果根据下式计算植物细胞的渗透势 x = -i C R T式中， x为细胞的渗透势（以 MPa表示，0.1013255MP a1atm,1MP a=106Pa） ；i 为溶液的等渗系数（蔗糖溶液的 i=1） ；C 为与细胞液等渗的外液浓度，即上面算出的两溶液浓度的平均值（应
28、以重量克分子浓度为单位，但溶液较稀时，可认为容积克分子浓度与重量克分子浓度相等） ；T 为绝对温度，T273+t,t 为实验时的室温（摄氏温度） ；R 为气体常数，R0.08205atml/molK。思考题什么是植物细胞的渗透势，它在细胞与周围环境的水分平衡中起什么作用？实验六 叶绿体色素及其理化性质叶绿体色素是参与光合作用的主要内在条件，普遍存在于绿藻及高等植物的绿色细胞内，有数十种之多，包括三大类：叶绿素类、胡萝卜素类和藻色素类。一、叶绿体色素的提取原理叶绿素在叶绿体内以其亲水部分（叶绿酸部分）与蛋白质结合，亲脂部分（叶绿醇部分）与类脂结合，纯的有机溶剂不能打破色素与蛋白质的联系，所以必须
29、用能与水混溶的有机溶剂并有少量水存在时，才能将叶绿体色素提取出来。常用的有机溶剂是酒精、丙酮等。材料与设备鲜菠菜、研钵、乙醇实验步骤称取 5g 鲜菠菜，放在研钵中加入 5ml 95%酒精及少许 CaCO3 粉未及石英砂研碎，再加入 15ml 95%酒精搅匀，将研磨液用粗滤纸过滤，滤液即为叶绿体色素粗提液，为深绿色，内含叶绿素 a、叶绿素b、胡萝卜素、叶黄素及其它脂溶性物质。保存此液备用。二、叶绿素的荧光现象原理物质具有不同的能态，物质中的某些电子吸收了光量子的能量后，物质从原来稳定状态的能级跳跃到一个较高的能级。这种稳定状态被称为基态；电子从基态跳跃到较高能级的现象称为激发；激发状态的电子称为
30、激发态电子。叶绿体色素分子吸收光量子后，使其分子内的电子跃迁而变为激发态，由于激发能未被适当的接受体接受，被激发的电子便迅速回复到原来的能量水平，释放的能量除一部分转变为热能而损失，通常释放出比原来吸收光的波长更长的荧光或磷光，如下图所示：11因此我们看到反射光（荧光）为暗红色，这种现象就称为荧光现象。当光透过叶绿体色素溶液时，被色素吸收了红光，剩下互补色绿光，所以透射光为绿色。材料与设备叶绿体色素提取液、光源（阳光或灯光） 、试管数支实验步骤取叶绿体色素提取液少量，如果太浓可加少量 95酒精进行稀释，观察；透射光为绿色，反射光为暗红色，说明叶绿素具荧光现象。三、叶绿素的皂化作用原理叶绿素是一
31、种双羧酸的酯类物质，能与碱发生皂化反应而生成叶绿酸的碱性盐，其化学反应如下：形成盐后，叶绿素的亲水性大大加强，可溶于稀酒精中。材料与设备叶绿体色素提取液、试管、移液管；20KOH甲醇溶液、苯实验步骤取 3ml 叶绿体色素提取液， （如提取液太浓，可先加少量酒精稀释） 。加入 1ml 20%KOH甲醇溶液，充分摇匀。放置片刻后，加入 3ml 苯，混合后，慢慢加入 1ml 蒸馏水，得到三层溶液，上层是苯溶液，其中溶有胡萝卜素及叶黄素；下层是酒精溶液，其中溶有已皂化的叶绿素 a，b 及少量叶黄素。试管底部同时出现白色沉淀现象，这是由细胞蛋白质产生的乳化现象。另取 3ml 叶绿体色素提取液，直接加入
32、3ml 苯和 1ml 蒸馏水，因叶绿素未经皂化，较易溶于上层的苯溶液层中；与皂化过的不同，在下层酒精溶液中，只溶有一部分叶黄素。四、叶绿素与类胡萝卜素的吸收光谱原理由于叶绿素与类胡萝卜素的分子结构不同，它们具有不同的吸收光谱。类胡萝卜素吸收蓝紫光，叶绿素吸收红光和蓝紫光。材料与设备叶绿素和类胡萝卜素提取液、分光镜、光源、有色铅笔。实验步骤首先调节分光镜，使能清晰地观察到光源的连续光谱，然后分别观察叶绿素和类胡萝卜素提取液的吸收光谱。将观察所得到结果用有色铅笔绘图表示，并说明这两类色素在光谱中吸收区域有何不同。五、氢和铜对叶绿素中镁的代替作用12原理叶绿素分子具有卟啉环，它的镁离子位于卟啉环的中
33、央，叶绿素分子较不稳定，遇酸后，中央的镁易被氢取代，在有其它重金属离子存在时，氢又易被其它重金属元素所取代。材料和设备叶绿体色素提取液、试管、烧杯、酒精灯、浓盐酸、醋酸铜结晶实验步骤取 5ml 叶绿素提取液，加入一滴浓盐酸，搅动后可见溶液渐渐由绿色变为褐色，此时盐酸中的氢已经代替了叶绿素中的镁，形成了去镁叶绿素。取一半去镁叶绿素溶液，加入少许醋酸铜结晶，徐徐加热，此时去镁叶绿素中的氢又被铜所取代，变为翠绿色。思考题1在用新鲜叶片提取叶绿体色素时，为什么要加入一定量的 CaCO3?2新鲜的植物叶片是否能够用不含水的有机溶剂提取？为什么？3对着光源和背着光源观察时，叶绿素提取液的颜色为何不同？实验
34、七 叶绿体色素的分离纸层析法原理叶绿体色素中的各种色素化学结构不同，因而它们的物理化学性质如极性、吸收光谱、溶解度等也不同。叶绿素和类胡萝卜素是酯类化合物，不溶于水仅溶于已烷、石油醚等非极性溶剂中，可利用不同色素在各种有机溶剂中的分配系数以及在吸附剂上被吸附程度的不同而将叶绿体色素分离开。材料与设备色层分析用滤纸、10cm 直径的培养皿（底和盖的直径要求相同） ；直径 1cm 的短玻管（长 1.5cm） 、汽油、苯浓叶绿体色素提取液（提取方法同前实验）实验步骤取一张色层分析滤纸，剪成方形，其边长略大于培养皿的直径，在其中心打一小圆孔。另取 1 小长条分析滤纸，将浓叶绿体色素提取液涂在滤纸条的一
35、条长边上，并使所涂的色带尽量窄，使之风干；连续涂四、五次，待风干后将滤纸条搓成二公分的纸捻，并将点样端插入方形滤纸的中心，作为“灯心” 。取大型培养皿一个，其中放一短玻管，管内盛有少量汽油约占玻管容积的 1/2 至 2/3，加入一、二滴苯。将上法制备的“灯心”插入小玻管中，把培养皿盖好，放在弱光下或暗处。用滤纸制成的“灯心”借毛细管作用吸收溶剂，溶于溶剂中的色素随之向四周扩散，1020 分钟后可得到不同颜色的色素同心环：叶绿素 a 为蓝绿色，叶绿素 b 为黄绿色，叶黄素呈鲜黄色，胡萝卜素则为橙黄色。在做好的色环滤纸片上注明色素种类名称，附在实验报告内。思考题1指出纸层析上色素环各是什么色素？并
36、说明为什么会出现这样的顺序。实验八 叶绿素的定量测定原理根据叶绿素对可见光的吸收光谱，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，而后用公式计算出叶绿素含量，此法精确度高，且能在未经分离的情况下分别测出叶绿素 a、b 的含量。根据朗伯比尔定律，某有色溶液的光密度 D 与其浓度 C 及液层厚度 L 成正比，即：13DkCL式中 k 为比例常数，当溶液浓度以重量百分浓度为单位，液层厚度为 1 厘米时，k 称为该物质的比吸收系数。如果溶液中有数种吸光物质，则此溶液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。叶绿素 a、b 在红光区的最大吸收峰分别位于 663nm
37、和 645nm，在波长 663nm 下，叶绿素 a、b 的80丙酮溶液的比吸收系数分别为 82.04 和 9.27，在波长 645nm 下分别为 16.75 和 45.6，可据此列出下列关系式：D 66382.04C a+9.27Cb （1）D 64516.75C a+45.6Cb （2）解方程式（1） 、 （2）得：C a=12.7D6632.59D 645 （3）C b=22.9D6454.67D 663 （4）式中的 D663 和 D645 为叶绿素溶液在波长 663nm 和 645nm 时的消光度，C a 和 Cb 分别为叶绿素 a 和 b的浓度，以毫克/升为单位。将 Ca 与 Cb
38、相加，即得叶绿素总量 CT。C T（mg/l）C a+Cb=20.2D645+8.02D663 （5）另外，由于叶绿素 a、b 在 652nm 处有相同的比吸收系数（均为 34.5） ，也可在此波长下测定一次消光度（D 652）而求出叶绿素 a、b 的总量：CT（mg/l）= （6）5341062.D材料与设备菠菜叶或其它新鲜叶片、丙酮、研钵、漏斗、天平、剪刀、烧杯、滤纸、量筒、分光光度计。实验步骤称取新鲜叶片 0.5 克，剪碎置研钵中，加少量碳酸钙和石英砂，并加入 2-3ml 80丙酮，研成匀浆，再加入 10ml 80丙酮，继续研磨充分，用一层加丙酮湿润过的滤纸过滤，再用少量丙酮将滤纸和研钵
39、上的色素冲洗干净，定容至 25ml 容量瓶中，摇匀。吸取叶绿素丙酮提取液 2ml，加 80%丙酮 2ml 稀释后，倒入 1cm 比色杯中，用分光光度计分别在波长 645nm、663nm 和 652nm 下测定光密度，以 80丙酮为空白对照。按公式（3） 、 （4） 、 （6）分别计算叶绿素 a、b 浓度及总浓度（毫克/升）按下式计算叶绿素在叶片中的含量：叶绿素含量 mg/克鲜重 10样 品 重 （ 克 ） 稀 释 倍 数提 取 液 总 量TC思考题1叶绿素 a、b 在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素 a、b 的定量分析？为什么？实验九 植物光合强度的测定改良半叶法原理根据叶中脉两侧结构及生理功能的相似性，可以先剪下半叶置于暗中，剩下的半叶待进行一定时间的光合作用后，有干物质积累，在隔断光合产物往外运输的情况下
