1、黄 葵素对结核分枝杆菌的抑杀作用研究摘要 目的 评价黄葵素 (huangkuisu，HKS)抗结核分枝杆菌的活性 。 方法 采用人型结核分枝杆菌标准菌株(H37RV)、多药耐药结核菌株 ，分别接种于含有不同浓度黄葵素 、空白对照和阳性药物的结核菌培养基 ，观察结核分枝杆菌的生长情况 ，评价其体外抗菌活性 。 尾静脉注射一定数量的结核分枝杆菌标准株 H37Rv 和耐药株菌液 ，建立小鼠结核分枝杆菌感染模型 。随机将模型小鼠分成利福平治疗组 、黄葵素治疗组 ，持续治疗 6 周 ，对照组给予生理盐水治疗 。以各组小鼠的肺组织和脾组织病理变化 、组织荷菌量 ，比较各组治疗效果 ，评价其体内抗菌活性 。
2、结果 模型组菌落生长情况正常 ，黄葵素 (100 mg/mL)、利福平 （5 mg/mL）组结核分枝杆菌 (H37RV)培养终止期未见菌落生长 ；恢复培养 40 d仍无结核菌生长 。 黄葵素在 100 mg/mL 时显示出对临床多耐药株的较好的抑杀作用 ，与利福平组比较 ，各时间点均显示出统计学意义 （P0.05）。 结核杆菌 H37Rv 感染小鼠 ，各治疗组肺组织和脾组织的病理变化较轻 ，肺和脾组织荷菌量明显降低 ，与模型对照组比较有统计学意义 （P0.05）。 结核杆菌耐药株感染小鼠黄葵素治疗组小鼠组织器官的病理变化较轻 ，肺组织和脾组织的荷菌量明显减少 ，与利福平组 、模型对照组比较有统
3、计学意义 （P0.05）。 结论 黄葵素在体内外对结核杆菌有抑杀作用 ，可以作为治疗耐药株感染的候选药物进一步研究 。关键词 黄葵素 ；结核分枝杆菌 ；小鼠 ；抗菌活性中图分类号 R2855 文献标识码 B 文章编号 doi:10.3969/j.issn.1674070X.2011.11.006.019.05Effects of Huangkuisu on killing and suppressingmycobacterium tuberculosisWU Can-rong1, CAI Rui1, LI Shan1, SHEN Ke-jia1, JIA Ben-zheng2, LI Fang
4、-rong2(1. TCM University of Hunan, Changsha, Hunan 410208, China;2. Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410006, China)Abstract Objective To evaluate the antituberculous activities of Huangkuisu (HKS). Meth-ods Standard human strains of mycobacterium tuberculosis (H37RV) and multi-drug
5、 resistant TBstrains were inoculated in different concentrations of HKS, blank control and positive TB drug cul-ture medium to observe the growth of mycobacterium tuberculosis and evaluate the antibacterial ac-tivity in vitro. Certain number of standard strains of Mycobacterium tuberculosis H37Rv an
6、ddrug-resistant strains were injected into the tail vein to establish a mouse model of mycobacteriumtuberculosis infection. The mice were randomly divided into treatment group, rifampicin, HKS treat-ment group treated lasting for 6 weeks; the control group was given normal saline. The antibacteriala
7、ctivity in vivo were evaluated to compare the treatment results according to the pathologicalchanges in lung and spleen tissues (HE staining and acid-fast staining) and charging amount ofbacteria. Results the bactreial colonies were grew normally in model group, but were not grew in伍参荣1，蔡 锐1，李 珊1，申可
8、佳1，贾本真2，李芳荣2（1.湖南中医药大学病原免疫学教研室 ，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药研究院 ，湖南 长沙 410006）收稿日期 201110-08作者简介 伍参荣 （1951），女 ，湖南长沙人 ，教授 ，博士研究生导师 ，研究方向 ：中医药抗感染性疾病的免疫学机制 。2011 年 11 月第 31 卷第 11 期Nov 2011 Vol 31 No 11湖南中医药大学学报Journal of TCM Univ of Hunan 19结 核病是一种慢性传染病 ，近 20 年来 ，由于艾滋病的传播以及耐药等因素的影响 ， 全球结核发病率呈上升势 。目前认为 ，耐药性结核分枝
9、杆菌广泛传播是结核病流行的主要原因1，临床上已发现结核分枝杆菌菌株对多种一线抗结核药物耐药2，因此 ，研制新型抗结核药物有其必要性 ， 从中药中筛选抗结核新药是其有效途径之一 。 黄葵素是从天然药物中筛选出的新型化合物 小檗碱离子对化合物 （专利号 ：200510136655）， 研究中发现该药能抗多种病原体 ，特别是抗胞内菌感染 。现将其抗结核杆菌研究结果报告如下 。1 材料与方法11 材料1.11 试验菌株 H37RV 标准菌 (ATCC：27294)本室保存菌株 ； 多药耐药菌株 (INHR，SMR，RFPR，EMBR，KA/R，IRO/R)编号 005101 由湖南省结核病院检验科提供
10、 。 从培养基中称取 0.1 mg 菌落 ，加入0.5 mL 生理盐水与苏通培养液 (体积比为 13)的混合稀释液分别接种于改良罗氏培养基3斜面上 。 置37 培养 。 18 d 后分别取改良罗氏培养基上生长良好的菌落于研磨器中 ， 加少量含 005Tween80的生理盐水研磨均匀 ，稀释成白色均匀混浊的菌液 。显微镜下计数 ，调整细菌浓度为 3107个 mL（供试验用 ）。1.12 试验药物 黄葵素干粉由湖南中医药研究院药物研究所提供 ，批号 ：20070212，用含 2%乙醇生理盐水稀释成 1 g/mL，4 保存备用 。 利福平胶囊 （0.3 g/粒 ，浙江医药股份有限公司新昌制药厂 ，批
11、号 ：20061209001），实验时先用少许乙醇溶解 ，再用无菌蒸馏水稀释至 5 mg mL。113 动物 KM 小鼠 70 只 ，SPF 级体质量 （18.02.0）g 雌雄各半 ，购自湖南莱克景达实验动物有限公司 ，许可证号 ：SCXK2009-0004。 饲养于 (212)、湿度 (5515)、可以方便获取食物和水的负压感染动物房内 。1.2 方法1.2.1 体外抗菌实验34改良罗氏培养基分别制成含药和不含药平皿 ，即 ：不含药的空白对照组 ；阳性对照组 (利福平 5 mgmL)； 含不同浓度黄葵素组(100，50，25， 12.5，6.2，3.2 mg/mL)，各组培养基每平皿 15
12、 mL。取上述菌悬液 0.1 mL 接种于各含药培养基表面 ，每个浓度设 5 个平皿 ，置 37 培养 ，每 5 d观察 1 次 ，40 d 后以模型对照组结核分枝杆菌长满培基表面为终止培养标准 ，计数各皿菌落数 。1.2.2 药物抑制培养后结核分枝杆菌恢复培养试验 经含药培养基培养 40 d 后 ，对无肉眼可见菌落生长的培养基表面物 ，进行结核分枝杆菌恢复培养 。用生理盐水洗下无菌落生长的培养基表面颗粒状物 ， 离心沉淀后接种于改良罗氏培基平皿 ，37 培养 ， 每 5 d 观察 1 次 ，40 d 后终止培养 ， 计数菌落数 ，标准菌株 H37RV 为对照 ，每浓度做 5 皿 。进一步评价
13、药物对结核分枝杆菌的抑制作用 。1.2.3 药物小鼠体内抗菌实验56小鼠按体质量分层后随机分为 7 组 ，每组 10 只 ，分别为正常组 、模型组 、黄葵素组 、阳性药对照组 。除正常对照组外 ，其他组小鼠造模 ； 每只小鼠尾部静脉注射 0.1 mL 经0.05Tween80 生理盐水稀释的 H37Rv 菌液 ， 含活菌数约 3105个 。 （1）正常小鼠对照组 (NG)：每只小鼠尾部静脉注射 0.1 mL 0.05Tween80 的无菌生理盐水 。 从第 2 天灌胃生理盐水 1 次 /d，每周灌胃 5次 ，0.2 mL/只 ，持续 6 周 。 （2）模型组 ：包括标准株HKS and Rif
14、ampicin groups in cultured termination; resume training 40 d still no tuberculosisbacteria growth. HKS in 100 mg/mL was showing multi-drug-resistant strains of clinical suppres-sion of better killing effect, compared with rifampin group, at each time point was indicative ofstatistical significance (
15、P0.05). in the mice infected by H37Rv, the lung and spleen tissuepathological changes in each treatment groups were light, the bacterial load in lung and spleentissues were significantly reduced compared with the control group (P0.05). Resistant strains ofmice infected with mycobacterium tuberculosi
16、s in HKS group the bacterial load in lung andspleen tissues was significantly reduced compared with rifampin group and model control groups(P0.05). Conclusion HKS is effective for killing and suppressing mycobacterium tuberculosis invitro and in vivo, which canbe studied further as a drug against th
17、e drug fast tuberculosis.Key words Huangkuisu (HKS); mycobacterium tuberculosis; mice; pharmacodynamics湖南中医药大学学报 2011 年第 31 卷20注 ：LSD 分析 P0.05，示 Q 检验与模型组比较 *P0.05；与利福平组比较 #P0.05。表 1 黄葵素试管中对结核杆菌生长的抑制作用 （n=5，xs）H37RV(MH37RG)和多耐药株模型 （MDNG）对照组 ：感染 1 d 后 ，每只小鼠生理盐水每天灌胃 1 次 ，每周灌胃 5 次 ，0.2 mL/只 /次 ，持续 6 周 。
18、 （3）阳性药对照（利福平组 RFG）即 H37RV(RFH37RG)和多耐药株(RFDNG)治疗组 ：感染 1 d 后 ，每只小鼠利福平 150mgkg 每天灌胃 1 次 ， 每周灌胃 5次 ，0.2 mL/只 /次 ，持续 6 周 。黄葵素治疗组 （黄葵素组 HKSG）即标准株 H37Rv(HKSH37RG)和多耐药株 (HKUSDNG)治疗组 ：感染 1 d 后 ，每只小鼠黄葵素 75 mgkg 灌胃 ，灌胃前用 0.5%黄耆胶制成混悬液 ，每天灌胃 1 次 ，每周灌胃 5 次 ，0.2 mL/只 /次 ，持续 6 周 。1.2.4 药物对组织载菌量的影响 采用二氧化碳窒息法处死小鼠 ，
19、75%的乙醇溶液消毒小鼠体表5 min，于生物安全柜内解剖小鼠 ，取脾脏和肺脏 ，分别置于灭菌研磨器中 ， 每个脏器加 2.0 mL 无菌生理盐水匀浆 ，并进行系列稀释 ，每个脏器稀释 5 个浓度 ，每个浓度做 3 个试管 ，每管取 0.1 mL 涂布于改良罗氏培基中 ，37 培养 ，观察菌落生长情况 ，40d 后计数菌落 。1.2.5 药物对感染组织病理学的影响 每组随机取5 只小鼠无菌分离出小鼠脾脏和肺脏 ， 置入 10%的甲醛溶液固定 ，苏木精 -伊红 （HE）和抗酸染色切片 ，观察感染组织病理变化 。1.3 统计学分析数据以 “xs”表示 ，采用 SPSS 15.0 软件 ，组间比较采
20、用单因素方差分析 ，LSD 方差分析法 ，P005为差异有统计学意义 。2 结果与分析2.1 黄葵素对结核杆菌的体外抑杀作用表 1 可以看出黄葵素对 H37RV 标准菌抑杀作用强于多耐药株 ， 黄葵素 100 mg/mL 时对 H37RV标准菌抑杀作用和利福平比较无统计学意义 （P0.05）；同样黄葵素在 100 mg/mL 时显示出对临床多耐药株的较好的抑杀作用 ，与利福平组比较 ，各时间点差别均显示出统计学意义 （P0.05）。组 别HKSG1HKSG2HKSG3HKSG4HKSG5HKSG6RFG培基对照模型对照不同观察时间 H37RV 落生长数 （个 ）1025 d 30 d 35 d
21、 40 d 2.000.01* 3.301.00* 4.001.00* 6.221.21* 7.051.02* 9.161.87* 7.652.31* 7.652.31* 10.002.12* 10.001.20* 13.502.12* 15.001.34* 13.893.12* 22.523.46* 42.003.60 20.002.12 39.003.41 41.963.33不同观察时间多耐药株菌落生长数 （个 ）1020 d 25 d 30 d 35 d 40 d 2.000.02*2.000.02*5.800.02* 2.000.0188.011.02*15.122.15*31.003
22、.00* 4.001.00*12.212038*21.332.14*35.093.14* 8.001.13*11.002.538*22.002.63*36.003.76* 8.211.26*12.002.25*22.002.34*36.633.15* 22.002.9637.763.98*39.493.46*39.493.46* 19.8802.36 40.372.67 43.003.134 43.003.13 2 0.001.36 39.873.10 42.573.19 42.573.19100502512.56.23.25药物试管中抑制培养后的结核杆菌恢复培养结果显示 ： 黄葵素 100
23、mg/mL 恢复培养 30 d 后肉眼观察无可见菌落生长 ，40 d 时肉眼可见菌落数为4.021.12， 而空白管为 51.433.10， 显示出药物对H37RV 标准菌较好的抑杀作用 。2.2 黄葵素小鼠体内抑杀结核杆菌的作用表 2 可以看出黄葵素与利福平治疗组与模型组比较均能显示出较好的抗菌作用 （P0.05）。 黄葵素对 H37RV 标准菌感染小鼠抑杀作用与 RFG 组比较无差异 （P0.05），对多耐药株感染小鼠体内的抑杀作用强于 RFG，RFG 多耐药株组小鼠肺组织与脾组织载菌量高于 HKSG，有统计学意义 （P0.05），提示黄葵素对结核杆菌多耐药株有较好的抑杀作用 。2.3 药
24、物对结核杆菌感染小鼠组织病理学的影响（1）药物对标准株 H37Rv 感染小鼠肺组织病理学影响 各组肺组织病理切片图显示 （图 13），治疗 6 周后模型组小鼠正常肺组织结构消失 ， 充血实变 ，肺泡腔内充满淋巴细胞 、巨噬细胞 ，肺泡间隔不存在 ，肺部病变严重 、广泛 ，增生性改变不明显 ；利福平治疗组无明显的病理改变 ； 黄葵素治疗组肺组织结构无明显的病理变化 。高倍镜下观察 ：模型组小鼠肺组织内可见圆形的结节状病灶 ， 灶内可见较多的上皮样细胞 、淋巴细胞及纤维组织 ，和多核巨细胞 。黄葵素组与利福平组小鼠肺组织高倍镜下与模型组比较淋巴细胞以及多核巨细胞明显减少 ， 未见结节药物浓度mg/
25、mL伍参荣 ，等 黄葵素对结核分枝杆菌的抑杀作用研究第 11 期 21注 ：F 检验 ：F=22.68，P0.05。 q 检验 ： 与相应菌株的模型组比较#P0.05；与相应菌株的利福平治疗组比较 *P0.05。表 2 黄葵素对结核杆菌感染小鼠肺和脾组织载菌量的影响 （n=10）组 别NGMH37RGMDNGRFH37RGRFMDNGHKSH37RGHKUSDNG状病灶 。 模型组结核结节内可见成簇排列的抗酸杆菌 ； 黄葵素治疗组小鼠肺组织抗酸染色菌密度明显低于模型组 ， 有效减少了肺组织病变部位定植的结核杆菌数量 。（2）药物对 H37Rv 感染小鼠脾组织病理学影响模型组小鼠感染 H37Rv
26、 后脾淋巴小结增大 ，脾窦及红髓的外套丛充血 ，淋巴细胞增生 ，淋巴小结内生发中心增生 ；黄葵素 、利福平组小鼠脾脏淋巴小结轻度增大 ，病变程度较模型组小鼠明显减轻 ；高倍镜下模型组小鼠脾组织淋巴小结内淋巴细胞 、巨噬细胞 、中性粒细胞浸润 ，可见渗出物 ；黄葵素与利福平组治疗组小鼠脾组织淋巴小结内淋巴细胞 、巨噬细胞 、中性粒细胞浸润较模型组小鼠明显减少 ，无炎性渗出 ；模型组脾组织内结核杆菌数量明显多于黄葵素组 、利福平治疗组 （图 46）。（3）药物对多耐菌株实验小鼠肺组织病理学影响多耐药株模型组 、利福平组小鼠肺组织正常肺泡结构消失 ，有弥漫性病变 ，多个结核结节融合 ，呈现浸润型肺结
27、核表现 ，肺泡腔内可见浆液 、单核细胞 、淋巴细胞和中性粒细胞 ，有肺水肿 。 高倍镜下肺组织结核结节内干酪样坏死 ，结节的边缘淋巴细胞和成纤维细胞明显增多 ；肺结核结节灶内有紫红色短杆状微弯曲的杆菌密布 。黄葵素治疗组未见明显的结节融合与干酪样坏死 ，病变部位局限 ，肺间隔炎症较轻 ，肺间质及血管周围炎细胞浸润少 ， 病变部位抗酸杆菌散在分布 ，含菌量较模型组 、利福平组小鼠减少 （图 79）。肺脏 脾脏 10.640.86 8.230.519.860.74 8.370.725.160.65#5.840.46#8.710.64#8.230.54#5.220.75#5.790.53#6.700
28、.67*#7.060.56*#药物浓度 （mgmL）1501507575湖南中医药大学学报 2011 年第 31 卷22（4）药物对多耐菌株实验小鼠脾组织病理学影响 图 1013 可见模型组 、RFG 小鼠脾组织内脾索及脾窦可见大量的中性粒细胞 、 单核细胞及网状内皮细胞 ；脾索及脾窦破坏严重 ，脾小体萎缩 ，有多个结核结节 ， 和结核杆菌 。 与模型组比较 HKSG 小鼠脾组织充血 ，病变较轻 ，淋巴小结轻度增大 ，病变部位的细菌量也较少 。3 讨论结核病是一种的慢性传染病 ，又称为痨病和 “白色瘟疫 ”。自 20 世纪 90 年代以来 ，结核病在全球 “死灰复燃 ”， 每年有近 900 万
29、新发病例 ，150 多万人死亡72-5。 造成严重的公共卫生问题和重大的经济社会问题 。 结核病呈上升趋势根本的原因是结核分支杆菌耐多药性的产生 ，使原有的抗结核病治疗方案 ( 即一线抗痨药 ，二线抗痨药治疗方案 ) 受到了很大的冲击 ， 使原有的抗结核病的治疗规程失去了应有的作用7135，8。 因此 ，研制新型抗结核药物有其必要性 。黄葵素为小檗碱离子对化合物 ， 本次体外抗菌作用研究结果显示 : 黄葵素与利福平组比较 ，对H37RV 标准菌有抑杀作用 ，两组差别无统计学意义（P0.05）； 但对多耐药株的抑杀作用均强于利福平组 ，各时间点差别均显示出统计学意义 （P0.05）。通过尾静脉注
30、射结核杆菌建立小鼠结核感染模型910观察感染小鼠组织的病理变化 ，研究表明黄葵素能明显减轻小鼠肺 、脾组织的结核病理损伤 ，以及减少细菌在组织内的定植 。 对结核分枝杆菌标准株感染鼠脏器的保护与利福平作用相当 （P0.05）；更重要的是黄葵素能有效的杀灭定植在小鼠体内的多耐药结核菌 ，减轻耐药细菌对脏器的损害程度 。器官载菌量是动物实验中观察抗结核感染疗效的重要指标11，本次研究结果表明 ：药物治疗 60 d后 ， 黄葵素与利福平治疗组均能显示出较好的抗菌作用 ，两组间差别无统计学意义 （P0.05）；对小鼠体内感染的多耐药株菌抑杀作用黄葵素强于利福平 ，多耐药株利福平治疗组小鼠肺组织载菌量比
31、黄葵素组高 2.01（P0.05），脾脏组织载菌量比黄葵素组高1.19（P0.05），提示黄葵素对感染机体的多耐药结核杆菌有较好的抑杀作用 。综上所述 ， 从天然药物中筛选出的离子对化合物黄葵素在体内外均显示出较好的抗结核杆菌作用 ，其机理值得深入探讨 。参考文献 ：1 刘剑君 ，姜世闻 ，成诗明 中国结核病控制现状分析及对策 J中国防痨杂志 ，2003，25(3)：129-1312 Shah NS，W right A，Bai GH，et a1. Worldwide emergence ofextensively drug -resistant tuberculosis J. Emerg In
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