1、第15卷第6期 2008年11月 地学前缘(中国地质大学(北京)；北京大学) Earth Science Frontiers(China University of Geosciences，Bering；Peking University) V0115 No6 NOV2008 污水处理系统中活性污泥细菌多样性研究 姜 昕 。， 马鸣超 ， 李 俊。一， 鲁安怀 ， 钟佐粢 1北京大学地球与空间科学学院，北京100871 2北京市环境保护科学研究院，北京100037 3中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京100081 4中国地质大学(北京)水资源与环境学院，北京100083 Jiang
2、Xin ，Ma Mingchao。，Li Jun。一，Lu Anhuai ，Zhong Zuoshen 1School of Earth and Space Sciences，Peking University，Beijing 100871，China 2Beijing Municipal Research Institute of Environmental Protection，BeUing 100037，China 3Institute of Agricultural Resources and Regional Planning，Chinese Academy of Agricultu
3、re Science，Beijing 100081，China 4School of Water Resources and Environment，China University of Geosciences(Beijing)，BeOing 100083，China Jiang Xin，Ma Mingchao，Li Jim，et a1Analysis on the bacterial diversity of active sludge in wastewater treatment plantEarth ScienceFrontiers，2008，15(6)：163-168 Abstra
4、ct：A bacterial 16S rDNA gene clone library was constructed to investigate the bacterial diversity of ac tive sludge in Gaobeidian Wastewater Treatment Plant，BeijingThe results indicated that，the bacterial diver sity of active sludge was very high，and the clones could be divided into 5 different grou
5、psThe dominant bac terial community was proteobacteria，which accounted for 767 The order of predominancy of bacterial communities are as follows：the 7-proteobacteria(398 )，the uncultured bacteria(2233 )，the 7-pro teobacteria(2015 )，the a-proteobacteria(679 )and the 3-proteobacteria(485 )The Nitrosom
6、onas- like and Nitrospira-like bacteria，such as Nitrosomonas sp(194 )and uncultured Nitrospirae bacterium (1165 )were also found，which have played important roles in oxidation of ammonia and nitrite in the sys ternHowever，they were only of a small amount because of their slow growth and less competi
7、tive advantage than heterotrophic bacteriaDenitrifying bacteria like Thauera spwas at a high percentage，and it suggests that the active sludge has a stronge denitrifying effectRoseomonas spwas also found in the clone library， which could be related to the degradation of organophosphorus pesticide Ke
8、y words：active sludge；microbial molecular ecology；16S rDNA clone library；bacterial diversity；Gaobeidi an Wastewater Treatment Plant 摘要：采用分子生物学手段16S rDNA克隆文库方法对北京高碑店污水处理厂回流污泥中的细菌进行了多 样性研究。结果表明，活性污泥系统中细菌群落具有高度多样性，所有克隆子分属5个不同的细菌类群，优势 细菌类群为变形茵(proteobacteria)，占克隆文库的767 ；细菌类群优势依次为 变形菌类群(-proteobac teria，
9、占398 )、不可培养茵类群(uncultured bacteria，占2233 )、7-变形菌类群(7-proteobacteria，占 2O15 )、旷变形茵类群(旷pr0te0bacteria，占679 )和 变形茵类群( proteobacteria，占485 )；活性污泥 中起硝化作用的主要是亚硝化单胞茵(Nitrosomonas sp，占194 )和硝化螺旋菌(uncultured Nitrospirae 收稿日期：2008101O；修回日期：20081O一3O 基金项目：国家重点基础研究发展计划“973”项目(G2007CB8156OO)；国家科技支撑项目(2O06BAD25Bo
10、4) 作者简介：姜昕(1969一)，女，副研究员，博士后，微生物学专业，现主要从事环境和农业微生物学研究。 通讯作者简介：李俊，研究员，博士生导师，微生物学专业，主要从事农业微生物学研究。E-mail：jlieaasaccn 164 姜昕，马鸡超，李俊，等地学前缘(Earth Science Frontiers)g008，15 f6) bacterium，占1165 )，由于这2种硝化茵自身生长缓慢，难以与异养细菌竞争，以致其在文库中的比例较 低；而作为反硝化细菌的陶厄氏茵属在文库中的比例却高达2718 ，可见该活性污泥具有较强的反硝化能 力；克隆文库中还发现了少量的玫瑰单胞菌属(占485)，
11、推测它的存在和有机磷的降解有关。 关键词：活性污泥；微生物分子生态技术；16S rDNA克隆文库；细菌多样性；高碑店污水处理厂 中图分类号：Q938文献标志码：A文章编号：10052321(2008)06016306 北京高碑店污水处理厂地处北京东郊，是北京 市城市总体规划拟建的16座城市污水厂中规模最 大、也是目前全国最大的污水处理厂。工程分别在 1993年和1999年通过两期建设，目前日处理污水 100万m。，占北京市污水处理总量的4O 。在工艺 设计方面，处理流程采用的工艺为前置缺氧段活性 污泥法；一级处理包括格栅、泵房、曝气沉砂池和矩 形平流沉淀池；二级处理采用推流式曝气池；污泥处 理
12、采用中温两级消化工艺。 近年来，对高碑店污水处理厂工艺技术方面的 研究较多，而对其中起降解作用的细菌多样性的研 究罕见报道，且仅有的少数研究所采用的方法大多 基于传统的纯培养法，而该法只能对环境样品中“可 计数、可培养”的细菌(只占细菌总数的1 10 ) 提供信息1，并且不能很好地反映微生物种群存在 的原始状态2，因此获得的结果难以客观、全面地反 映活性污泥系统菌群的多样性。随着不依赖分离培 养的微生物分子生态学技术的发展，通过分析环境 样品的克隆文库序列3，可以对环境样品中所有细 菌进行多样性研究。克隆文库的构建是微生物分子 生态学中用来研究微生物组成的常用方法之一，目 前细菌菌群分析中应用
13、最多的是16S rDNA克隆文 库方法。该方法无需分离培养，大大增加了人们检 测和鉴定环境中“非培养”微生物的能力，已被广泛 地应用到水体、土壤、海洋沉积物、生物水处理系统 等的细菌多样性研究_4_ ，极大地丰富了环境微生物 资源库，并可以用于指导细菌的分离培养。 本文采用建立16S rDNA克隆文库的方法，通 过测序并与GenBank已知序列BLAST比对确定 细菌种类，以揭示活性污泥系统中的细菌多样性，确 定其中的优势类群，同时也可以根据克隆文库中克 隆子出现的频率了解系统中菌群的构成比例。 1材料与方法 11样品采集 活性污泥样品于2006年8月取自北京高碑店 污水处理厂的回流污泥，进水
14、水样取自初沉池进水 口，出水水样取自二沉池的出水端。 12实验方法 (1)样品总DNA提取及纯化。采用间接法，对 活性污泥样品进行总DNA的提取。用灭菌的 TENP buffer(50 mmolL Trisbase，20 1TimolL EDTA，100 mmolL NaC1，O01 gmL PVP，pH 10)，旋涡振荡污泥样品，离心去上清液，重复至上清 液澄清；沉淀溶于PBS buffer(8 g NaC1，02 g KC1， 144 g Na2HPO4，024 g KH2PO4，溶于1 L水，pH 74)，差速离心收集菌体；将菌体转入带有O型密 封环的2 mL螺旋I=I离心管中，加入90
15、0 pL裂解液 (NaCl 500 mmolL，Tris_HC1(pH 80)50 mmol L，EDTA 50 mmolL，SDS 40 mgmL)，1 g 01 mm瓷珠，酚一氯仿一异戊醇抽提液700 L，涡旋使沉 淀充分悬浮，将离心管置于珠式细胞破碎器(MINI BEADBEATER)上均质化(3 200 rrain)2 rain，上 清液继续用酚一氯仿一异戊醇抽提；DNA粗体液采用 PCR-clean-up kit试剂盒纯化。 (2)PCR扩增。16S rDNA全长PCR扩增： 以样品总DNA为模板，采用16S rDNA基因特异 性的引物对P。和P。进行PCR扩增。反应体系见 参考文献
16、ElO；反应条件为，采用降落PCR策略，即 预变性9515 rain，复性：9505 rain，60 05 rain，722 rain，5个循环；9505 rain，55 05 rain，722 rain，5个循环；9505 rain， 5O05 rain，722 rain，15个循环；最后在6O 下延伸10 rain。PCR反应的产物用10 琼脂糖 凝胶电泳检测。Reconditioning PCREn：反应体 系中以15 L第一轮PCR产物为模板，其余同前； 反应条件：9505 rain，9505 rain，5O05 rain和722 rain，5个循环，最后在72下延伸6 rain。PC
17、R反应的产物用1。O 琼脂糖凝胶电泳检 测。 (3)克隆文库的构建。使用上海生工生物工程 技术服务有限公司胶回收试剂盒UNIQ-10胶回收 柱对Reconditioning PCR产物进行割胶纯化，并测 姜听，马鸣超，李俊，等地学前缘(Earth Science Frontiers)2008，15(6) 165 定回收后PCR产物浓度，然后与pMD19-T载体连 接，转化大肠杆菌DH5a，涂板，37培养12 h后， 进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆子，用限制性内切酶 Csp 6和Hinf 1分型，每个酶切类型挑取一个代 表菌株进行测序(上海生工)。用DNA Man、Gene Tool等软件对测序结
18、果进行编辑、分析，并把编辑 好的序列在GenBank数据库中进行BLAST同源 性检索后下载同源性序列。系统发育树的绘制使用 MEGA 31软件完成，算法为邻位相连法(neigh- bour-joininganalysis)。 (4)水样测定。主要水质监测指标有：C)Dc ， NH 一N和TN，其中，用重铬酸钾法测定COD ，纳 氏试剂分光光度法测定NH 一N，碱性过硫酸钾消解 紫外分光光度法测定TN。 2数据分析与讨论 21总DNA提取和PCR扩增结果 对活性污泥样品提取的DNA进行电泳检测， 条带大小为1O kb左右，满足后续试验要求；以其为 模板进行16S rDNA全长PCR扩增，得到约
19、1 500 bp的大小片段(图la)；再采用Thompson等口l_提 出的“Reconditioning PCR”的方法，消除了异源双 链DNA(heteroduplex)，保证了目的片段的特异性 扩增，为后续试验提供了理想的模板(图lb)。 3000bp l500 bp 1000bp 3000bp 1500 bp l000 bp (b) 16S rDNA PCR产物及“Reconditioning PCR”产物电泳图像 Fig1 Agarose gel electrophoresis of PCR&“Reconditioning PCR”amplified 16S rDNA 22 16S
20、rDNA系统发育分析 只有当文库的库容大到足以检出群落中主要的 成员时，文库之间的比较才有意义。为了保证构建 的克隆文库足够大，能够检测出群落中主要的成员， 需要对实验数据进行统计学检验。以覆盖率C评 估所构建文库对细菌多样性的体现程度，计算公式 为 C一1一( 1N)100 其中，N代表阳性克隆子总数，T 代表仅含单 个克隆子的数量1 。本实验中 为6，克隆文库的 覆盖率为942 ，表明该克隆文库能较全面地反映 活性污泥系统中的细菌种群多样性。 对随机挑取样品的103个阳性克隆采用限制性 内切酶Csp 6和Hinf工酶切，共得25个酶切类 型。每个酶切类型挑取一个代表克隆子进行测序， 测序结
21、果在GeneBank数据库中进行BLAST比 对，将序列比对结果相同的克隆子定义为一个操作 分类单元(operational taxonomic unit，OTU)。活 性污泥样品共得到21个OTU，样品中主要OTU 所含克隆子数目及其相似性菌株如表1所示。 在活性污泥样品的克隆文库中，21个OTU分 别属于细菌域的5个主要类群，主要是or变形菌(cc proteobacterium)、t?-变形菌(t3一proteobacterium)、7一 变形菌(7一proteobacterium)、6一变形菌(-proteobac terium)和不可培养菌(uncultured bacterium)
22、，其 中，属于变形菌(proteobacterium)的克隆子占总数 的767 ，这与Snaidr等”学者对常规活性污泥 中菌群多样性的研究结论较为吻合，即活性污泥池 中的优势类群为Proteobacteria类群(约占8l )。 研究同时表明，在克隆文库中，f_变形菌是主要的优 势菌群，占文库比例的398 ；其次某些不可培养 菌(uncultured bacterium)和 变形菌(T-pro teobacterium)，分别占文库比例的2233 和 2015 ，这与Wagner等学者根据对多篇关于废水 生物处理反应器中细菌群落结构的研究报告的总结 得出的结论一致，即j3一变形菌纲和拟杆菌纲
23、是废水 处理系统中的最优势类群1 ，f-变形菌不仅在数量 上占有优势，而且在有机物的降解、营养物质的去除 以及絮状体结构的形成方面都起着重要作用L1引。 在该系统中，CODe 进水浓度为3337 mgL，出水 浓度260 mgL，去除率91。6 96，Proteobacteria类 群是C0D去除的主要因素。 陶厄氏菌属(Thauera sp)在克隆文库中的比 例很大，占2718 ，该菌属是一类反硝化细菌，可 以经反硝化作用去除污水中的NO。一Nl1引，其在反硝 化以及降解有机物，特别是芳香族化合物的降解过 程中起了非常重要的作用_1 ，而且这类菌在反硝化 类型的废水处理装置中含有的比例较高1
24、 ，因此可 166 姜昕，马鸣超，李俊 等地学前缘(Earth Science Frontiers)2008，15(6) 表1活性污泥样品主要细菌16S rDNA克隆文库分析结果 Table 1 Data of bacterial 1 6S rDNA clone 1ibrary constructed with active sludge 系统类群 O编U号T 含克隆数 nBa 盛 细菌 相似度 以认为北京高碑店污水处理厂的活性污泥具有较强 的反硝化能力，这一点，可以由其对TN的去除率高 达7O1 进一步证实(TN进水浓度571 mgL，出 水浓度171 ragL)。 在本实验构建的克隆文库中
25、，还发现了亚硝化 单胞菌属(Nitrosomonas sp)和硝化螺旋菌(uncul tured Nitrospiraebacterium)，分别占文库比例的 194 和1165 。亚硝化单胞菌属是一类氨氧化 菌，负责将NH 一N氧化为NO2一N，是生物脱氮过程 中的限速步骤。硝化螺旋菌是重要的亚硝酸盐氧化 细菌，近几年来的研究表明，在很多生境的硝化过程 中，真正起亚硝酸盐氧化作用的可能是硝化螺旋菌 属的细菌，而非硝化杆菌属(nitrobacter)这一传统 硝化菌属的菌种19-20。正是在这两类菌的作用下， 该系统才完成了对NH 一N的去除，其中NH 一N进 水浓度388 mgL，出水浓度3
26、78 mgI ，去除率 903 。这两类硝化细菌尤其是亚硝化单胞菌属， 在活性污泥菌群中的比例较小，可能是由于它们自 身生长缓慢，在与异养细菌共同生存时没有时空方 面的竞争优势，从而受到抑制所致。 克隆文库中还发现了少量的玫瑰单胞菌属 (Roseomonas sp)，占文库库容的485 ，该菌属是 一类能够有效地降解有机磷农药的革兰氏阴性 菌_2 ，它的存在和该污水处理厂处理的一部分工业 废水有关。 用OTU代表克隆子的碱基序列构建在Gene Bank数据库中进行BLAsT比对，同源性检索后下 载相应序列，绘制系统发育树(图2)。结果表明，与 活性污泥中细菌相似性较高的(_变形菌纲菌属主要 是
27、动胶菌属(Z ramigera)、陶厄氏菌属(Thauera sp)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas sp)和一些 不可培养菌(uncultured bacterium)；7一变形菌纲的 细菌主要是甲基球菌属(Methylobacter sp)和一些 不可培养菌(uncultured bacterium)；a一变形菌纲的 细菌主要是柄杆菌属(Caulobacter sp)和玫瑰单胞 菌属(uncultured Roseomonas sp)；样品中属于 一 变形菌纲的细菌大多是不可培养菌。 3结论与建议 本研究表明，北京高碑店污水处理厂活性污泥 系统中的细菌具有高度的多样性，通过克隆文
28、库分 析得出存在5个不同的细菌类群，优势细菌类群为 变形菌，占克隆文库的767 ；细菌类群优势顺序 为_变形菌(占398 96)、不可培养菌(占2233 )、 7一变形菌(占201 )、a一变形菌(679 )和 变形 菌(485 )。克隆文库中的陶厄氏菌属(Thauera sp)的比例很大，占文库的2718 ，由于该类细菌 姜昕马鸣超李俊，等地学前缘(Earth Science Frontiers)200815(6) l 8-proteobacterium 图2活性污泥样品细菌系统发育树 Fig2 Phylogenetic tree of the bacteria in active slud
29、ge 本文中的克隆子以OTU开头标识，参照细菌序列引自GenBank数据库，括号中的数字代表提交序号，分支节点上 的数字表示每1 000次bootstrap分析所支持的次数，线段表示2 序列差异的分支长度 可以经反硝化作用去除污水中的NO。一N，经常出现 在反硝化类型的废水处理装置中，因此可以认为北 京高碑店污水处理厂的活性污泥具有较强的反硝化 能力，其对TN的去除率为701 。 克隆文库中发现了亚硝化单胞菌(占194 ) 和硝化螺旋菌(占1165 )，它们分别承担了反应 系统中氨氧化和亚硝酸盐氧化的工作。由于硝化细 菌自身生长缓慢，在与异养细菌共同生存时没有时 空方面的竞争优势，从而导致其在
30、文库中的比例较 低。克隆文库中还发现了少量的能够有效地降解有 167 机磷农药的玫瑰单胞菌属(占485 96)，与存在含磷 的工业废水有关。 通过本研究，建立了一套研究活性污泥样品 菌群多样性的方法，构建16S rDNA克隆文库可以 定量的研究样品细菌多样性，但耗时长，工作量 大，不适合研究样品多样性动态变化规律，因此可 借助变性梯度凝胶电泳温度梯度凝胶电泳技术， 对高碑店污水处理厂不同阶段活性污泥中的菌群 分布进行分析，进一步探讨其与处理效果之间的 关系。 168 References： 姜昕，马鸡超，李俊，等地学前缘(Earth Science Frontiers)2008，15 f6)
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