1、荧光定量 PCR 实验的影响因素小结引物的设计和选择符合荧光 PCR 的探针并进行设计对于实时荧光 PCR 尤其重要。可以说，不合理的设计意味着绝对的失败。但是，好的设计并不等于好的实验结果，影响 PCR 和荧光 PCR 的因素非常多，下面择其重要进行介绍。1、引物退火温度引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当 50的引物和互补序列表现为双链 DNA 分子时的温度。Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从 55到 70。退火温度一般设定比引物的 Tm 低 5。设定 Tm 有几
2、种公式。确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法。大部分计算机程序使用近邻分析法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。所有 oligo 软件会自动计算引物的 Tm 值。在设置退火温度时可以如下进行：以低于估算的 Tm5作为起始的退火温度，以 2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的 Tm 值。引物对的 Tm 差异如果超过 5，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物 Tm不同，将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5。或者为了提高特异性，可以在根据较高 Tm 设计的退火温度先进
3、行 5 个循环，然后再根据较低 Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。2 、引物浓度引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在 0.1 到 0.5M。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过 Beers 法则（公式 1）计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式 2 计算。与大分子双链 DNA 可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在oligo 软件上可以计算出引
4、物的的消光系数（OD/mol）和消光系数的倒数（mol/OD）。一般商业合成的引物以 O.D.值表示量的多少，在一般情况下，20 个碱基长的引物，1 个 O.D.加 100ul 水后引物浓度为 50pmol/ul（50M）。也可以用OLIGO 软件，根据引物的的消光系数（OD/mol），计算出一定的工作浓度下，引物的加水量。浓度(M)A260（OD/ml）稀释系数消光系数的倒数（nmol/OD）举例：计算某寡核苷酸（溶于 1ml 水中），取其中的 10l 稀释 100 倍（加入 990l）水中。在 A260 处测吸光度为 0.2。计算消光系数的倒数为 4.8 nmol/OD，代入得：浓度0.2
5、（OD/ml）1004.8（nmol/OD）96nmol/ml96M3、引物、探针的纯度和稳定性定制引物的标准纯度对于大多数 PCR 应用是足够的。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为 DNA 合成化学的效率不是 100。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使 DNA 从 3到 5合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于 50 个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在 TE 重溶引物，使其最终浓度为 100M。也可以用双蒸水溶解。引物的稳定性依赖于储存
6、条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20。以大于 10M 浓度溶于 TE 的引物在-20可以稳定保存 6 个月，但在室温（15到30）仅能保存不到 1 周。干粉引物可以在-20保存至少 1 年，在室温（15到 30）最多可以保存 2 个月。探针即寡核苷酸进行荧光基团的标记，标记本身有效率的区别。探针标记以后一般应该纯化，纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高，且保存时间可以高达一年以上。不同的生物技术公司探针标记效率和纯度有很大的区别。由于反复冻融易导致探针降解，在确认探针质量好的情况下，最好稀释成2uM（10），作为工作浓度分装多支，避光保存。4 、热启动热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，
7、提高 PCR 特异性最重要的方法之一。尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行 PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动 PCR 尤为有效。限制 Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR 反应液，并将其置于预热的 PCR 仪。这种方法简单便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种基
8、本成分延迟 DNA 合成，直到 PCR 仪达到变性温度。包括延缓加入 Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。Transitor Hot Start Taq 酶对于自动热启动 PCR 来说高效可靠。Transitor Hot Start Taq 是在常规 Taq 酶的基础上进行了化学修饰，使得该酶在低温或常温下没有酶活
9、，因此在加样至 PCR 扩增前，不会产生由于引物随机粘连而形成的非特异性扩增。高温条件下，化学修饰集团会被剪切，从而释放酶活。此外，随着 PCR 扩增的进行，酶活会被逐步释放，有效提高扩增效率及产物量。Transitor Hot Start Taq DNA 聚合酶在变性步骤的 95保温过程中要持续 20 分钟才会被释放到反应中，从而完全恢复聚合酶活性。5、镁离子浓度镁离子影响 PCR 的多个方面，如 DNA 聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP 和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含 200M
10、 dNTP 的实时定量 PCR，使用 3 到 5mM 带有荧光探针的镁离子溶液（普通 PCR 是 1.5mM）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，普通 PCR 从 1mM 到 3mM，以0.5mM 递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用 Transitor Hot Start Taq 酶。Transitor Hot Start Taq DNA 聚合酶能够在比一般的 Taq DNA 聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化。6、模板质量模板的质量会影响产量。DNA 样品中发现有多种污染物会抑制 PCR。一些在
11、标准基因组 DNA 制备中使用的试剂，如 SDS，在浓度低至 0.01时就会抑制扩增反应。分离基因组 DNA 较新的方法包括了 DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及 FTA Gene Guard System，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存 DNA。应注意进行 PCR 反应的模板质量，以增加 PCR 反应的成功率。7、模板浓度起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数 PCR 扩增和荧光 PCR 扩增，104 到 106 个起始目的分子就足以观测到好的荧光曲线（或在溴化乙锭染色胶上观察到）。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（下表）。举例说，100ng到 1g 的人类基因组
12、 DNA，相当于 3104 到 3105 个分子，足以检测到单拷贝基因的 PCR 产物。质粒 DNA 比较小，因此加入到 PCR 中的 DNA 的量是 pg 级的。对于一般的检测样品，10100ng 的量就足够检测了。当然对模板做一个梯度稀释，对于定量 PCR 而言是非常容易，且能分析扩增效率。8、防止残余（Carry-over）污染PCR 易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源 DNA 污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其他样品中纯化的 DNA 或克隆的 DNA 也会是污染源（非残余污染）。可以在
13、PCR 过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。使用带滤芯的移液管可以阻止气雾剂进入 eppendorf 管内。为 PCR 样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG）。这种酶（也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或 UNG）移除 DNA 中的尿嘧啶。在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板 DNA 区分开来。因为前面的扩增产物对 UDG 敏感，所有可以在 PCR 前对新配制的反应用 UDG 处理以破坏残余产物。
