1、1果蔬成分生化分析果蔬成分的分析主要分为四个方面：维生素 C 含量的测定、总糖和还原糖含量的测定、蛋白质含量的测定、过氧化物酶的分析。总体从实验目的、实验原理、实验试剂、实验结果和分析的角度进行分析一实验目的：1、掌握微量测定维生素 C 的方法和技术。2、了解果蔬中维生素 C 含量。3、掌握总糖和还原糖含量的测定方法。4、掌握蛋白质测定的方法和技术。5、了解果蔬中蛋白质的含量。6、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构特点。二实验原理：1.还原型维生素 C 可被氧化型 2，6-二氯酚靛酚（下面简称染料）所氧化，成为氧化型维生素 C。氧化型染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。成为还原型
2、后为无色。用氧化型染料来滴定还原型维生素 C，当滴至全部还原型维生素 C 被氧化后，在稍滴一点呈微红色为终点。滴定用去染料量与样品中还原型维生素 C 量成正比。 （此法虽简单迅速，但氧化型染料亦能使其他还原型物质氧化，所以有一定缺点。 ）2.蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。其原理：糖类在较高温度下可被硫酸脱水成糠醛或糠醛衍生物，再与蒽酮缩合成蓝色化合物，在 620nm 处有最大吸收。多糖为非还原糖，可用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行测定，这样就可分别求出总糖和还原糖的含量。3. 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的
3、测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝 G-250 在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在 465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在 595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为 595nm 处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定 595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和考马斯亮蓝 G-250 结合，在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下 1 小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋
4、白质含量。4. 用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质，主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再2与标准样品对照即可确定各区带的成分。5. 在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。 三实验试剂：1%草酸溶液、2%草酸溶液、维生素 C 标准液、氧化型 0.1% 2，6-二氯酚靛酚溶液、各种果蔬、蒽酮试剂、标准葡萄糖溶液（0.1mg/mL） 、6mol/L HCl 溶液、20% NaOH 溶液、标准蛋白质溶液、考马斯亮兰 G-250 染料试剂、0.05mol/L TrisHCl 缓冲液
5、（pH6.8） 、0.1 mol/L 磷酸缓冲液 pH7.6、反应混合液。四实验结果及分析：1.果蔬中维生素 C 的定量测定操作：1、制备新鲜果蔬液：如洗净新鲜橘子，擦干表面水分，剥去外皮，称 20.0g 橘子放入50mL 量筒中，加 2%草酸液至 40mL 刻度处（即稀释 1 倍） 。用玻璃棒搅拌，静置 10 分钟，过滤，滤液即是（若样品中含大量铁，可用 8%醋酸溶液提取，可在一定程度上延缓 Fe2+ 还原染料） 。2、染料液装入滴定管中：应驱除滴定管中的气泡，调整好零点。3、滴定维生素 C 标准液：吸取 1.0mL 维生素 C 标准液放入锥形瓶中，加 9mL1%草酸溶液，摇匀，用染料液滴定
6、至微红色保持 15 秒不褪色即为终点。记下所用去染料液数量，可算出 1mL 染料相当于多少 mg 维生素 C。4、滴定样品液：吸取 10.0mL 样品液放入锥形瓶中，同上操作进行滴定。可做两份，求平均值。实验结果：Vc 标液用去 2,6-二氧靛酚 0.3ml萝卜：20.06g，定容到 40ml ，每 10ml 消耗 2,6-二氧靛酚：0.85ml;结果得：每一百克样品中维生素 C 含量 m = 100=5.99mg盘菜 ：21.26g，定容到 40ml ，每 10ml 消耗 2,6-二氧靛酚：1.0ml;结果得：每一百克样品中维生素 C 含量 m = 100=6.21mg结果分析：不同果蔬中的
7、维生素的含量不相同，如盘菜和萝卜中的 Vc 含量有差异，造成这种差异的原因可能是：1. 没有将果蔬充分的碾碎，维生素没有完全释放出来，或者一部分残留在实验仪器上；VCWVCW32. 在过滤多的时候，没有过滤完全，存在残渣；3. 在移液时，常常把液体从一个容器移到另一个容器中，使实验的误差较大；4. 在滴定时，没有明确液体刚变红的概念，可能滴得太多；5. 滴定的时间花费太长，还原性的物质发生了氧化。2.总糖和还原糖含量的测定操作：1、葡萄糖标准曲线的绘制，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）为横坐标做图得标准曲线。2、样品中还原糖的提取和测定称取 1g 实验材料，加水约 3mL，在研钵中
8、磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约 30mL蒸馏水冲洗研钵 23 次，洗出液也转入三角烧瓶中。于 50水浴中保温约 0.5h（使还原糖浸出） ，取出，冷却后定容至 100mL。 过滤后冰箱保存。不同果蔬需进行不同程度稀释。葡萄：取滤液 0.5mL100mL；梨：取滤液1mL100mL；盘菜、萝卜取滤液 10mL100mL 。取 1mL 最终稀释液置于试管中，浸于冰浴中冷却，再加入 4mL 蒽酮试剂，沸水浴中煮沸 10min，取出冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同。测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。3、样品中总糖的提取、水解和测定称取 1g 实验材料，加水约 3mL，在研钵中磨成匀浆
9、，转入三角烧瓶中，并用约 12mL蒸馏水冲洗研钵 23 次，洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入 6mol/L 盐酸10mL，搅拌均匀后在沸水浴中水解 0.5h，冷却后用 20%NaOH 溶液中和至 pH 呈中性。然后用蒸馏水定容至 100mL， 过滤后冰箱保存。不同果蔬需进行不同程度稀释。葡萄：取滤液 0.5mL200mL；梨：取滤液5mL100mL；盘菜、萝卜：取滤液 10mL100mL 。取 1mL 总糖的最终稀释液同上法进行还原糖测定。实验结果：标准曲线的绘制：0 1 2 3 4 5标准葡萄糖溶液/mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.54蒸馏水 1.0 0.9 0.8
10、0.7 0.6 0.5置冰水浴中 5min蒽酮试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0煮沸 10，冷却后室温放置 10，在 620nm 处比色A620nm 0 0.043 0.182 0.257 0.409 0.456葡萄糖标准曲线 还原糖： 由标准曲线的溶液的浓度为：计算结果：萝卜 0.246 0.027mg/ml W= 100%=2.7%盘菜 0.337 0.037mg/ml W=3.7%总糖：萝卜 0.427 0.047mg/ml W=4.7%盘菜 0.354 0.039mg/ml W=3.9%结果分析：在绘制葡萄糖标准曲线时，应使图上的点尽量聚集在直线附近，各标准液浓度与该
11、溶液的C1V1m5吸光度呈线性关系，测定计算时可先根据标准液浓度查出该溶液的浓度，产生误差的可能的原因有：1.标准曲线绘制不够准确；2.实验过程中蒽酮试剂加进去后未摇匀；3.蒽酮加入的时间存在着间隔。3.果蔬中蛋白质含量的测定考马斯亮兰法操作：1、 标准曲线绘制加入考马斯亮蓝 G-250 蛋白试剂后，摇匀，放置 2min 后，在 595nm 波长下比色测定，记录 A595。以各管相应标准蛋白质含量（g）为横坐标、A 595 为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品制备称取 1g 待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入 1mLH2O 或 0.05mol/L TrisHCl 缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转
12、入离心管，再用 2mL 水或缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，3500rpm 离心 1520min，其上清液即为蛋白质的提取液，供分析用。3、样品测定试管中加自制蛋白质样品 1.0mL ，再加入 5.0mL 考马斯亮蓝 G-250 试剂，摇匀，放置 5min 后，在 595nm 波长下比色，记录 A595。根据所测 A595 从标准曲线上查得蛋白质含量 。实验结果：管号试剂0 1 2 3 45盘菜 萝卜100g/mL 牛血清白蛋白溶液mL0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 0蒸馏水mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0考马斯亮蓝液mL 5.0
13、5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0A595nm 0.000 0.178 0.343 0.480 0.613 0.725 0.160 0.9466蛋白质标准曲线由标准曲线可得：盘菜中蛋白质含量为 180ug;萝卜中蛋白质的含量为 136ug。结果分析实验中产生误差的原因可能是：1. 加入试剂后没有在指定的时间内进行比色反应，蛋白质失活较严重；2. 比色杯没有冲洗干净，存在一些残留在上面。4. 过氧化物同工酶的分离（聚丙烯酰胺凝胶电泳）操作1.贮液配制按上表配制贮液，但应注意（1）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放 12 个月。（2）过硫酸铵应当天配制。2. 电泳槽的安装
14、垂直板电泳槽的式样很多，目前流行的是用有机玻璃做的两个“半槽”组成的方形电泳槽，中间夹着凝胶模子，是由成套的两块玻璃板装入一个用硅酮橡胶做成的模套而构成，7由硅酮橡胶套决定两玻璃板之间距离约为 1.5mm，形成一个 “胶室”，胶就在这两板之间的胶室内聚合成平板胶。当凝胶模子与两半槽固定在一起后，凝胶槽子两侧形成前后两个槽，供装电极缓冲液和冷凝管用。将两块玻璃板用去污剂洗净，再用蒸馏水冲洗，直立干燥（勿用手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作），然后正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝，注意用力均衡以免夹碎玻璃板。安装好电泳槽用 pH8.9 缓冲液配制的 1.5琼脂溶液封底
15、，待琼脂凝固后即可灌制凝胶。3. 制胶将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。（1）配制分离胶 A 3mLC 6mL0.14%过硫酸铵 12mL水 3mLTEMED 15L将分离胶沿长玻璃板加入胶室内，小心不要产生气泡，加至距短玻璃板顶端 3cm 处，立即小心地覆盖 23mm 的水层，静置待聚合（约 40min），当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。（2）配制浓缩胶B 1.5mLD 3mLE 1.5mLF 6mLTEMED 18L注：TEMED 在灌胶前加，或者加完之后放在黑暗的环境中。先倒掉分离胶上的水层，用吸水纸将水层吸干，但不要弄坏分离胶。立即加入浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板
16、），待胶凝后，小心取出梳子。将稀释 10 倍的电极缓冲液倒入两槽中，上槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，下槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。4样品的制备8称取果蔬 2g，剪碎，放入研钵中，加适量石英砂及 5mL 的样品提取液研磨成匀浆，置于离心管中，研钵用少量提取液清洗，洗液并入离心管，以 14 000r/min 的转速离心15min，取上清液定溶至 10mL，贮存于低温冰箱备用。5点样先向上槽液中加入 0.1%溴酚蓝 34 滴，搅匀。用微量注射器（50L）吸取1020L 样液，在浓缩胶上层点样。点样时须小心，防止样品液扩散。6电泳接好电源线（上槽即加样槽为负极）。打开电源开关，调节电流到
17、 20mA 左右，样品进入到分离胶后加大到 30mA，维持恒流。待指示染料下行到距胶板末端 1cm 处，即可停止电泳。把调节旋扭调至零，关闭电源，电泳约 3h。7剥胶取出电泳胶板，去掉胶套，用微量注射器沿玻璃内面注入一定量的水后即可掀开玻璃，去掉浓缩胶（注意先进行测量），将分离胶放入培养皿。8染色、记录结果将配制好的染色液倒入培养皿，室温下 110min 后显示蓝色条带，后变红褐色。用去离子水漂洗，并拍照记录。实验结果：实验结果图：9萝卜：Rf=1.67.6=0.21盘菜：Rf1=4.67.6=0.61Rf2=1.67.6=0.21结果分析：有实验结果可知，盘菜有 2 条条带，萝卜只有 1 条
18、，由 Rf1Rf 可得盘菜的过氧化物酶电泳的速度快，可知盘菜中的过氧化物酶的分子量小，萝卜中的分子量较大。盘菜中有两条色带，可知盘菜中至少有两种过氧化物酶，但是萝卜中只看到一天清晰的可能的原因是，萝卜中只有一条过氧化物酶或者其他的过氧化物酶的含量较少。5. 过氧化物酶活性的测定（比色法）操作：1. 取上述的样品提取液 2.5mL，定容至 50mL 刻度，备用。2. 取光径 1cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液 3mL 和磷酸缓冲液 1mL，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3mL 和上述酶液 1mL（如酶活性过高可稀释之） ，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 47
19、0nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。实验结果：T 1 2 3 4 5 对照 0.000 0.000 0.000 0000 0.000盘菜 0.574 0.571 0.571 0.572 0.574萝卜 0.290 0.442 0.559 0.619 0.656计算结果：盘菜 第 1 分钟 第 2 分钟 第 3 分钟 第 4 分钟过氧化物酶活力 15 0 5 10过氧化物酶比活力 7.5 0 2.5 5萝卜 第 1 分钟 第 2 分钟 第 3 分钟 第 4 分钟过氧化物酶活力 760 585 300 185过氧化物酶比活力 380 292.5 150 92.5结果分析：有实验数据可知：
20、萝卜的过氧化物酶活力比盘菜强，盘菜第 2 分钟时酶的活性为 0，可能10的原因是盘菜制备的时间较长，使得盘菜中的过氧化物酶的活性不够，但是第 3、4 分钟时酶的活性得到了恢复，可能的原因是外界的温度使酶的活性发生了变化。萝卜中过氧化物酶的活性随着时间的增长而减弱，是符合酶的变化规律的，所以盘菜的实验误差较大。实验小结上述五个实验的分析与讨论，以及需要的注意点：实验一：（1）整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过 2min。滴定所用的染料不应小于 1mL 或多于 4mL，如果样品含维生素 C 太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。（2）提取的浆状物如不易过
21、滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。实验二：本次的实验整个过程较长，在整个过程中，若水浴加热时间不长，还原糖并未完全溶解，以及总糖的最终 PH 不为 7 都会给本实验的结果带来误差，而且样品 1g 很难控制的精确，也存在误差，在碾磨的过程中要充分的细，特别注意的是在测试总糖还原糖时也需要对照组实验三：如果测试要求很严格，可以在试剂中加入后 520min 内测定吸光度，因为在这段时间内颜色是最稳定的，比色反应需在 1h 内完成。 不可用手摸比色皿，可用塑料或玻璃比色皿，测定完后用 95%乙醇将蓝色的比色皿杯洗干净。 实验四：在用琼脂封底的时候，温度不能太低了，会使封底不密，从而会漏，导致实验重做。 在制胶的过程中不能把 TEMD 加的太早，因为会很容易的凝结。在制备样品的过程中，提取液要及时的放入冰箱中，因为酶在温度较高的条件下容易失活。在点样的时候必须要小心，防止样品的扩散。 在接通电源的时候，正负两极不能弄反了。在剥离胶时要小心，并且要加入一定量的水，这样可以防止胶片破碎。 在取下玻璃板时，要记住先量蓝带到凹槽的距离。实验五：由实验结果看，萝卜的过氧化物酶的活性大于盘菜，时间越长没得活性越低，所以要把握好时间，比色时要快速。比色皿光滑面不能弄脏，否则会影响实验结果。
