1、细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用 1PBS 溶液洗涤 2 次，每次加入 1mL PBS 溶液，1000r/min，4离心5min，弃上层液体。洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀） 。（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂 cocktail 的 RIPA 细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解 30min。如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞 2 次后加入含蛋白酶抑制剂 cocktail 和磷酸酶抑
2、制剂的1PBS 约 100L，1000r/min，4离心 5min 后，完全弃上层液体，置于 -80冰箱保存备用。（3）冰上超声处理细胞，每次超声 2s，间隔 3s，约 10-20 次。（4）13000r/min，4离心 15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的 1.5mL 离心管中，于-80冰箱保存备用。2. BCA 法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按 BCA 试剂 A 和试剂 B 体积比为 50:1 配制足量BCA 工作液，充分混匀，置于常温备用。（2）配制标准品取原标准品 BSA（2mg/mL ）约 100L，取出 50 L，用 ddH2O 按对数法稀释成如
3、下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置 96 孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入 20L 1PBS，从第三横排起，按浓度梯度由低到高依次取 20L 标准品至 96 孔板中，每一浓度做 2 个平行孔。（3）稀释待测样品取 5l 待测蛋白样品，用 ddH2O 稀释到 50L，分别取 20L 至 96 孔板中，每一浓度做 2 个平行孔；（4）分别加入 200L BCA 工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱 37孵育 30min。（5）将 96 孔板取出后用酶标仪测定 OD5
4、70nm 值。（6）根据标准品的 OD570nm 值绘制标准曲线，并根据标准曲线计算得到待测样品的蛋白质浓度。蛋白质变性（1）根据预计将要上样的蛋白质样品质量（25g-50gg，是蛋白质而定） ，取适量体积的蛋白质样品于预冷的 EP 管中，加入 5SDS 上样缓冲液（体积约为蛋白质样品体积的25%） ，通过调节上样缓冲液的体积将各样品混合液的终体积调节至相仿。用封口膜将离心管封口，7000r/min 离心点离样品混合液 3s，使其混合均匀。（2）将放置样品混合液的架子置于盛有适量 dd H2O 的磁盘中，用电磁炉加温至 100，煮沸 5min。点离样品，使其混合均匀。2.34.54. SDS-
5、PAGE 分离蛋白质根据将要检测的蛋白质大小，首先确定配制 10%的分离胶（10ml）：dd H2O 4ml30%Acr-Bis 3.3ml1.0MTris-HCl（pH8.8） 2.5ml10%SDS 0.1ml10%AP 0.1mlTEMED 0.005ml将配置好的液体吹打混匀，灌胶，再用注射器将 dd H2O 缓慢均匀的加于分离胶上层，待胶凝固后（光下可见明显的水胶分离线）将上层水倒掉，并用滤纸尽量将水吸干（注意不要碰到分离胶） 。然后配制 4%浓缩胶（3ml）：dd H2O 1.8ml30%Acr-Bis 0.4ml1.0MTris-HCl（pH6.8） 0.76ml10%SDS 0
6、.03ml10%AP 0.03mlTEMED 0.003ml将配置好的液体吹打混匀后，迅速灌胶并马上插入梳齿，待胶充分凝固后放入垂直电泳槽内，加入电泳缓冲液，小心将梳齿拔出，每孔加入等质量变性蛋白质（根据不同的蛋白质具体的上样质量会有所变化，但相同蛋白质的上样质量始终不变）后进行电泳。先采用80V 恒压电泳约 30min 后，改用 100V 恒压电泳约 2h（具体视溴酚蓝跑到胶的最底端的时间而定） 。2.34.6 转膜（1）预先裁剪出大小适宜的 PVDF 膜和滤纸，尽量使 PVDF 膜面积稍大于凝胶，但不大于海绵。 （2）电泳结束后，将凝胶剥下，小心的将浓缩胶切除，将分离胶浸泡于预冷的转移缓冲
7、液中约 15min，洗去杂质。（3）将 PVDF 膜完全浸泡在甲醇中约 30s。（4）在倒满转移缓冲液的塑料盘中依次加入转膜用的夹子（正极一侧在下，保持水平） 、一块海绵垫、滤纸、浸泡好的 PVDF 膜、浸泡好的凝胶、滤纸和另一块海绵垫，整个操作过程中要不断赶走气泡，在夹紧夹子前要确认各层中没有气泡（否则会影响转膜结果） 。（5）将夹子放入电泳转移槽中，确认夹子的正负极与转移槽正负极相对，整个转移槽埋在冰中进行转膜。根据将要检测的蛋白质分子量大小确定转膜时间，小分子蛋白一般为恒压80V，1.5h；大分子蛋白一般为恒压 100v，2h。（6）转膜结束后打开夹子，小心去除负极一端的海绵、滤纸和胶，
8、在 PVDF 膜的右上角剪一个角以确定正面，然后取出，根据预染蛋白 Marker 标准判断转膜效果及目的条带的大致位置。2.34.7 免疫反应（1）封闭：将 PVDF 膜浸泡于含 5%脱脂奶粉的 PBST 封闭液中（如要检测磷酸化蛋白，则需使用含 5%BSA 的 PBST 封闭液进行封闭） ，室温下摇床摇动封闭约 1-2h。（2）剪膜：依据预染蛋白 Marker 标准判断目的蛋白的条带位置，并将其小心剪下，膜的宽度应适当，并尽量保留周围可能出现条带的位置。（3）一抗孵育：用 5%BSA 溶液将一抗稀释至适宜浓度，并加入到大小合适的孵育槽中，将剪好的 PVDF 膜置于其中，稀释好的一抗应当至少没
9、过 PVDF 膜。4下摇床摇动封闭过夜。（4）洗膜：室温下，用 1PBST 在摇床上洗涤 PVDF 膜 4 次，每次 10min。（5）二抗孵育：根据一抗选择相应的羊抗鼠 IgG 二抗或羊抗兔 IgG 二抗，用含 5%脱脂奶粉的 PBST 将辣根过氧化物酶标记的二抗稀释至适宜浓度，并加入到大小合适的孵育槽中，将 PVDF 膜置于槽中，室温下摇床摇动孵育 2h。（6）洗膜：室温下，用 PBST 在摇床上洗涤 PVDF 膜 3 次，每次 10min。2.34.8 显影（1）用水冲洗好平板，将保鲜膜平整的铺于平板上，并用滤纸赶走气泡，将孵育好的PVDF 膜取出置于保鲜膜上，放置整齐，并用滤纸轻轻吸去
10、 PVDF 膜上的液体；（2）取适量 ECL 试剂 A、B 液等体积混合后滴于 PVDF 膜上，避光孵育 5min，用滤纸吸去剩余的发光试剂，并将平板放入凝胶扫描成像系统中，根据荧光强度确定曝光时间（5s-30min） 。待成像后将图片以.tif 格式保存。（3）用灰度分析软件 Quantity One 软件对实验结果进行灰度扫描。2.4 5 HDAC 组蛋白去乙酰化酶活性比色分析试剂盒检测 HDAC 活性（1）取对照组和实验组各 50g 待测蛋白质样品，用 ddH2O 将其稀释，使终体积为85l，并按 0M，1.25M，2.5M, 5.0M 浓度依次加入 96 孔酶标板中。（2）加入 10l
11、 10HDAC Assay Buffer 。（3）再加入 5l HDAC Colorimetric Substrate，彻底混匀。（4）在温箱中 37孵育 1h。（5）加入 10l Lysine Developer 并彻底混匀，终止反应。（6）在温箱中 37孵育 30min。（7）将 96 孔板取出后用酶标仪测定 A450 OD450nm 值。将其转化为酶的活性值并进行统计学分析。2.5 细胞周期及凋亡率检测（1）收集实验组和各个对照组 K562 细胞 5106 个，1000r/min，4离心 5min，弃去上清。（2）1PBS 洗涤细胞两次，1000r/min，4离心 5min，完全弃去上清。用手指轻弹细胞团，使其分散重悬。（3）每管加入约 1000l 预冷的 70%乙醇固定细胞，边滴边用手指弹匀。（4）置于-20冰箱中过夜。再送往公司进行细胞周期及凋亡率检测。2.6 统计学分析2.6.1 所有数据均采用 SPSS17.0 等进行处理及统计学分析，并以 P0.05 为有显著意义的检测标准。2.6.2 所有数据均用 表示，两组间比较采用 t 检验，以 P0.05 为有显著意义的检测标准。
