1、（一）Western-blot实验1. Western blot主要实验试剂溴酚蓝（Bromphenol Blue） 丽春红（Ponceau S ） 考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue R-250） 吐温-20 （Tween-20） -巯基乙醇(-Mercaptoethanol) 十二烷基硫酸钠（SDS ） 过硫酸铵（APS） TEMED 聚丙烯酰胺凝胶单体贮备溶液 4浓缩胶缓冲液 4浓缩 胶缓冲液 甘氨酸 Tris 碱 脱脂奶粉 牛血清白蛋白（BSA） 硝酸纤维素膜（NC 膜） 蛋白质 Marker 和预染 Marker 通用蛋白裂解/提取试剂 BCA 法蛋白定量试
2、剂盒 Bradford 法蛋白定量试剂盒 兔源性抗抗体 辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG ECL超敏发光液 定影液、显影液、X光胶片曝光盒其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）2. Western-blot 主要实验试剂的配制方法（1）10%SDS 溶液: SDS粉末1g,加双蒸水10mL使其溶解，室温保存。（2）10%APS ：APS 20mg,加双蒸水200L, 混匀，现配现用。（3）10 电极缓冲液（ PH8.3）: SDS粉末10g、Tris 碱30.4g、甘氨酸144g，双蒸水定溶至1000mL，4保存，用时 10倍稀释。（4）考马斯亮蓝固定液：乙醇500mL、冰醋酸10mL
3、、双蒸水定溶至1000mL。（5）考马斯亮蓝脱色溶液：95%乙醇250mL、冰醋酸80mL，双蒸水定溶至1000mL。（6）考马斯亮蓝染色溶液：0.29g考马斯亮蓝,溶解于250mL脱色液中，过滤后室温保存。（7）转移缓冲液：甘氨酸2.93g、Tris碱5.812g、甲醇 200mL、去离子水定溶至1000mL，4保存。（8）10TBS溶液：Nacl87.75g、Tris碱12.1g，用双蒸水溶至 1000mL，4 保存，用时10倍稀释。（9）TBST 溶液： 1TBS溶液1000mL 、Tween-20溶液1mL，混匀。（9）丽春红溶液：100g丽春红,5mL冰醋酸，双蒸水定溶至100mL，
4、室温保存。 （11）5 上样缓冲液： 1mol/LTris-HCl(pH6.8) 0.6mL、甘油2.5mL 、10% SDS溶液2mL、- 巯基乙醇（使用前加） 0.5mL、1%溴酚蓝溶液1mL，去离子水定溶至10mL，4 保存。 （12）12% 分离胶：聚丙烯酰胺单体贮备液3.2mL、4分离胶缓冲液0.5mL、10%SDS 溶液80L、10%APS溶液25L、TEMED原液10L、双蒸水溶至8mL。 （13）5% 浓缩胶：聚丙烯酰胺单体贮备液0.68mL、4浓缩胶贮备液0.25mL、10%SDS 溶液40L、10%APS溶液15L、TEMED原液5L、双蒸水溶至4mL。（14）NC膜封闭液
5、：脱脂奶粉1g，TBST溶液20mL中溶解，4保存。（15）抗体稀释液：TBST溶液20mL、小牛血清白蛋白1g，混匀，4保存。（16）Striping Buffer：-巯基乙醇 35L、10%SDS 溶液1mL、0.5MTris溶液(pH6.7) 625L，去离子水定溶至5mL，室温保存。3. Western-blot 实验步骤（1）总蛋白的提取 （采用北京普利莱公司蛋白质抽提试剂盒抽提）电子天平精确称取组织 50mg（2mg） ，放入含有 1mL 细胞裂解液和适量的PMSF（终浓度为 1mmoL/mL）的预冷玻璃匀浆器内，冰上匀浆。取 0.5mL 匀浆液移入新的 2mLEP 管内，加 1m
6、L 蛋白抽提试剂并混匀，静置10min 后（偶有颠倒混匀） ，12000g 4离心 10min。弃去上清保留蛋白质膜，加 2%SDS 溶液 500L，100水浴 10min，4放置2 小时使蛋白质膜充分溶解。（2）总蛋白浓度的测定（BCA 法）配制统一的蛋白质标准品：以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的标准品溶液（浓度为 1mg/mL）制作蛋白质标准曲线。分别吸取 BSA 标准品溶液 0、100、200、400、800、1200、1600 和 2000L，各自加入 0.01MPBS 溶液补足到 2000L，配成梯度浓度的标准品溶液，分装后-20备用。配制 BCA
7、 工作液：按 50：1 的比例将 BCA 试剂盒内的 A 试剂与 B 试剂进行混合，配成 BCA 工作液。室温保存， 1d 内使用。样品处理：取各样品 10L，加 0.01MPBS 溶液 490L，配成待测样品。加样：先于酶标板上样孔内加入 200L BCA 工作液，再分别加入倍比稀释的标准品及待测样品各 20L，酶标仪上震荡 3min，充分混匀。测定：将酶标板置于恒温水浴箱中，37 孵育 30min。用 MRK3 型酶标仪测定 562nm 波长下各孔吸光度值（optical density， OD） ，采用 Softmax5.2 软件计算各样本蛋白质浓度。 （3）样品浓度的配平和制备配平：按
8、测定的各样品蛋白质浓度，用 2%SDS 溶液配平各样品总蛋白浓度。根据预实验结果，将组织的总蛋白浓度调为 1mg/mL。制备：将配平后的样品与5 上样缓冲液按4：1的比例混合。 100水浴10min，部分4保存用于电泳，部分 -20保存备用。（4）样品内蛋白含量的检测凝胶的配制：配制12% 分离胶和5% 浓缩胶（配制方法见附录） 。上样：分别用Eppendorf微量移液器吸取蛋白质Marker或样品各10L，将枪尖的插入加样孔的底部，缓慢地将样品或Marker加入加样孔，避免有气泡产生。电泳：浓缩胶：电压100V、电流400mA，电泳20min；分离胶：120V，400mA，电泳50min，待
9、溴酚蓝到达凝胶底部，关闭电源。蛋白质转膜：恒压转移，转膜参数：电压100V，电流350mA，转移23min。结束后，将硝酸纤维素膜（nitrocellulose，NC膜）于丽春红染液中染色10 min，可见清晰的红色条带，表明转膜成功。去离子水冲洗，根据蛋白质Marker的位置将含有目的蛋白的膜条带上下各0.5cm）裁下。 封闭：把NC膜置于封闭液内室温封闭4h（摇床上进行） ，TBST 液洗膜2min3次。免疫反应：将封闭好的膜置于一抗溶液中4 孵育过夜，TBST 溶液洗3min5次后，NC膜再于辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG溶液中孵4育1h，用TBST溶液洗膜3min5 次。以上步骤均在摇
10、床上进行。曝光：将 ECL 超敏发光液中的 A 液和 B 液按 1：1 比例混合后滴于 NC 膜上，暗室内曝光 30s，X-光片在显影液中显影 2min，定影液中定影 5min。分析结果：将NC 膜上肌动蛋白染色条带结果扫描后输入电脑，IPP5.0图像分析系统分析结果。（二）免疫组化（荧光）染色实验1. 免疫组化（荧光）染色主要实验试剂防脱片剂一抗抗体免疫组化试剂盒（SP或SABC）DAB试剂盒 罗丹明标记的羊抗兔IgG 组织自身荧光淬灭剂 其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）均为国产分析纯2. 常用试剂的配制（1）0.01MPBS 溶液：中衫公司的PBS粉末一包，加蒸馏水2000
11、mL，混匀，室温保存。（2）4% 多聚甲醛溶液：500ml 0.01MPBS液加40g多聚甲醛在2000 ml的烧杯内加热至60，边搅拌边加热，至溶液呈澄清，另加500 ml 0.01MPBS液至1000 ml。冷却后过滤， 4冰箱保存备用。（3）苏木素：（4）伊红：3. HE 染色方法（1）二甲苯 I 脱蜡 10min（2）二甲苯 II、III 脱蜡各 5min（3）无水乙醇洗 1min2 次（4）95酒精 1min（5）90酒精 1min（6）85酒精 1min（7）自来水洗 2min（8）苏木素染色 15min（9）自来水洗 1min（10）1盐酸酒精分化 20s（11）自来水洗 1mi
12、n（12）稀氨水（1）反蓝 30s（13）自来水洗或蒸馏水洗 1min（14）伊红染色 20s5min（15）自来水洗 30s（16）85酒精脱水 20s（17）90酒精 30s（18）95酒精 1min（19）95酒精 1min（20）无水乙醇 2min（21）无水乙醇 2min（22）二甲苯 I、II、III 透明各 5min（23）中性树胶封片4.免疫组化染色(1)制作切片：组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE染色步骤进行；(2)抗原修复：0.01M 的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min，冷却至室温后，PBS溶液洗 3min3次；(3)封闭：封闭液室温封闭30min，弃去封闭液，
13、不洗；(4)免疫反应：滴加一抗抗体，4 孵育过夜（保湿盒内进行） ，PBS 溶液洗切片3min5次后，滴加二抗，室温4 孵育30min，PBS 溶液洗切片3min5 次；滴加DAB试剂、显色。显微镜观察切片，蒸馏水终止显色反应。脱水、透明、封片。(5)观察：每张切片随机选 5 个视野，扫描记录，并采用 IPP5.0 图像分析软件分析图像。5.免疫荧光染色(1)制作切片：组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE染色步骤进行；(2)抗原修复：0.01M 的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min，冷却至室温后，PBS溶液洗 3min3次；(3)封闭：封闭液室温封闭30min，弃去封闭液，不洗；(4)
14、免疫反应：滴加一抗抗体，4 孵育过夜（保湿盒内进行） ，PBS 溶液洗切片3min5次后，滴加罗丹明标记IgG，室温避光4 孵育30min，PBS溶液洗切片3min5次；滴加组织自发荧光淬灭剂，室温孵育30min，PBS溶液洗3min3次；滴加抗荧光淬灭封片剂封片，4避光保存。(5)观察：荧光显微镜观察切片，每张切片随机选 5 个视野，扫描记录，并采用IPP5.0 图像分析软件分析图像。（三）RT-PCR实验1. RT-PCR主要实验试剂TRIzol ReagentDEPCOne Step RNA PCR Kit (AMV)DNA Marker琼脂糖TrisMOPSMGP 试剂去离子甲酞胺去离
15、子甲醛 其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）均为国产分析纯2. 常用试剂的配制（1）DEPC 水 (v/v)：在 1000 ml 去离子水中加入 DEPC 1ml，37充分振荡过夜，高压灭菌。浸泡实验器具的 DEPC 水：在 1000 m 去离子水中加入 DEPC 1ml，充分振荡后即可使用。（2）75% 乙醇(DEPC 水配制):无水乙醉 375ml，加入 DEPC 水定容至 500ml。（3）0.5M EDAT (pH8.0): EDAT-2Na 186.1g，加 DEPC 水至 800ml，充分搅拌。用 NaOH 约 20g 调 pH 至 8.0，用 DEPC 水定容至 10
16、00ml。高温高压灭菌后分装,室温保存。（4）1Tri-HCl(pH8.0):Tris 121.1g，加 DEPC 水 800ml 搅拌溶解后，用浓 HCl约 42ml 调 pH 至 8.0，用 DEPC 水定容至 1000ml。高温高压灭菌后分装，室温保存“（5）10TE(pH8.0): 100mM Tris-HCI(pH8.0), 1mM EDAT(pH8.0), 加800mlDEPC水混合均匀后定容至 IL。高温高压灭菌后分装 ,室温保存。（6）EB 染液(200g/l)I:澳化乙锭 2.0mg，,加 DEPC 水至 10ml,充分搅拌数小时完全溶解后室温避光保存。（7）1MM 乙酸钠:
17、 68g 乙酸钠, 加 DEPC 水 400ml，搅拌,用 DEPC 水定容至500ml。 （8）10MOPS 电泳缓冲液:41.8gMOPS 溶解于 700ml 灭菌的 DEPC 水中,用 2M 的 NaOH 调整到 pH7.0, 加 20ml 乙酸钠和 20 ml MEDAT(pH8.0), 用DEPC 水调整到 1L, 避光保存。（9）10 甲醛变性琼脂糖凝胶：加 1.5g 琼脂糖到 72ml 灭菌去离子水中，煮沸溶解琼脂糖，将溶液冷却到 55同时加入 10ml 10xMOPS 电泳缓冲液和 18ml去离子甲醛后灌胶。（10）10 甲醛凝胶缓冲液：甘油 5ml, 25mg 固体澳酚蓝,
18、25mg 二甲苯青 FF, 10mM EDAT(PH8.0) 5ml 定容至 10m。（11）1.5% 琼脂糖凝胶：琼脂糖 1.5g，加入 100ml lTBE 电泳缓冲液 P(H8.3)后在微波炉内加热溶解，冷却至 55左右加入 EB 染液(终浓度 0.5g/l)充分混匀后灌胶。（12）5TBE 电泳缓冲液(pH8.3): 54gTris 碱，27.59 硼酸，20ml 0.5M EDAT(pH8.0),定容至 1L。（13）6 凝胶载样缓冲液：0.25%嗅酚蓝(m/v) 、0.25% 二甲苯青(m/V), 30%甘油水溶液，4保存。3. RNA 提取方法（1）组织取出后立刻至于液氮中。（2
19、）脑组织称取后在液氮存在下研磨 3 次成粉末状（需要磨成非常细的粉末,否则抽提效率会降低） 。（3）待液氮挥发干，立即加入 TRIzol，每 100mg 组织加 1ml TRIzol，用加样枪吹吸，使样品充分裂解，移入 1.5 ml EP 管中，静止 5min，以使核酸蛋白复合体完全分离。（4）在 EP 管中加 200L 氯仿，剧烈振荡 15 秒，静置 5min。（5）将 EP 管在 4 12000g，离心 15min，离心后混合物分离成一个较低的红色苯酚-氯仿的有机相，一个中间相和一个无色的上层的水相。（6）用移液器小心吸出上层水相(不要吸取中间白色的中间层)300ml，加入另一 EP 管中
20、。（7）加入 500 L 预冷过的异丙醇，振荡混匀。-20沉淀过夜。（8）4 12000g，离心 15min，此时在 EP 管中常常能看到白色沉淀，小自移出上清。（9）沉淀中加入 lml 预冷过的 75%乙醇，振荡混匀后 4 7500g，离心 5min。（10）重复用 75%乙醇洗涤 RNA 沉淀一次。（11）去上清，RNA 沉淀于空气干燥 5-10min，,加入 DEPC 水充分济解(难溶时可在 55-60孵育 10min 助溶。4. RNA 定量检测（1）提取适量总 RNA 用 1xTE 稀释 200 倍，以 1xTE 作为空白对照。（2）分别测定在 260nm 和 280nm 处的吸光值
21、，纯 RNA 的 OD260/OD280 比值应接近 2.0(比值最好在 1.7-2.0 之间)。(3)在 260nm 处的吸光度， 1OD=40g/ml NRA。浓度计算公式如下： A260 光密度值40稀释倍数/1000=g/l RNA。5、琼脂糖变性凝胶电泳质检 RNA（1）在 EP 管内建立变性反应:对照组总 RNA（约 5g） 2.0 l 10MOPS 电泳缓冲液 2.0 l 去离子甲醛 4.0 l 去离子甲酰胺 10.0l 澳化乙锭(200g/l) 1.0 l（2）将 EP 管置于水浴恒温器中 65 温育 5min，取出立刻置丁冰上 10min，然后离心 5s，将所有液体沉淀到 E
22、P 管内底部。（3）加 2.0 l 10甲醛凝胶缓冲液并重新置于冰上。（4）将 1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽内，加入足量 1MOPS 电泳缓冲液覆盖凝胶约 lmm，加 RNA 样品到凝胶加样孔中。（5）5V/cm 电压下电泳，直到溴酚蓝移出约 8 厘米，由于电泳过程中电泳缓冲液的 pH 值会发生变化，需每小时人工转变缓冲液。（6）紫外线下观察，拍照。提取质量较好 RNA 电泳结果为 5s、18s 和 28s 三条带清晰，没有明显的降解，28s RNA 条带是 18s RNA 条带亮度的两倍。6、RT-PCR 反应（1）按照试剂盒说明书加入试剂。（2）RT-PCR 反应。（3）反应结
23、束后，取 PCR 反应液各 5l 进行 1.5%琼脂糖凝胶（含 EB）电泳。（4）5V/em 电压下电泳 40min。（5）紫外线下观察，拍照。（四）ElISA实验1. RT-PCR主要实验试剂2.ElISA 操作步骤（1）取右心血液,在 4下 2000r/min 离心 10min,取上层血清。（2）取出 ELISA 试剂盒平衡至室温。（3）取出反应板每孔分别加入 20l 标准品、20l 血清于反应板孔中。（4）每孔加入 100l Zero Buffer,轻轻混匀 30 秒,室温温育 30min。（5）洗板:甩尽板内液体,用蒸馏水或者洗涤液洗涤反应板 ,并去除水滴( 在厚叠吸水纸上拍干),这样
24、反复洗涤 5 次。（6）每孔加入 150ul 酶联物(Reagent),轻轻混匀 10 秒,室温温育 30min。（7）洗板：与步骤 5 相同。（8）每孔加入 IO0l TMB 显色液，轻轻混匀 10 秒钟，置暗处室温温育 20 min。（9）每孔加入 50l 终止液(stop solution)，轻轻混匀 30s；确定兰色变为黄色(重要)，30min 内在 45Onm 处读 OD 值。（10）以 OD 值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据豚鼠血清样品的 OD 值可在标准曲线上查出其浓度。（5）原位杂交实验1. 原位杂交实验所需试剂TriS曲拉通 X-100吐温-20DEPCm
25、RNA 原位杂交试剂盒及专用盖玻片原位杂交寡核昔酸探针2. 原位杂交所需试剂的配制方法（1）DEPC 水：在 1000ml 去离子水中加入 DEPC 1ml，37 下充分振荡过夜，高温高压灭菌，浸泡实验器具的 DEPC 水：在 1000ml 去离子水中加入DEPC1ml 而，充分振荡后即可使用。（2）组织细胞打孔液：DEPC 处理的构椽酸缓冲液(0.01mol)99.5ml,加入曲拉通X-100 0.5ml，混匀即可。（3）DEPC 处理的 PBS 缓冲液：1000 ml PBS 缓冲液 (0.01mol)中加入 DEPC 1ml，荡过夜，高温高压灭菌。（4）0.1 mol TBS: 8.5g
26、 NaCI、l.2g Tris 用 DEPC 处理的去离子水定容至 I000ml,混匀, 用乙酸调 pH 至 7.5。（5）过氧化氢封闭液: 市售 30%的过氧化氢 10ml，加 DEPC 处理的 PBS 缓冲液定容至 100ml, 此液现用现配。（6）4% 多聚甲醛: 4g 多聚甲醛溶于 DEPC 处理的双蒸水 100ml 中, 50加热搅拌，滴加 IN 氢氧化钠直至白色的多聚甲醛完全溶解，3 号定性滤纸过滤备用。（7）20SSC 缓冲液的配制：氯化钠 175.3g、柠檬酸三钠 88.2g 加 DEPC 处理的去离子水混合均匀后定容至 1L。2SSC、0.2SSC 依次稀释 10 倍。3.
27、原位杂交实验步骤（1）取组织，于 DEPC 处理的 4%多聚甲醛中固定 2h，15% 蔗糖(4 )脱水 1 天,冰冻切片 12m。（2）原位杂交合成探针（8g/ml, 地高辛标记)（3）切片丙酮中浸泡 10min，DEPC 处理的 PBS(0.01M, pH7.4)冲洗 3min。（4）置打孔液中室温 10 分钟，以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利地穿透细胞膜，0.01 M PBS 冲洗 3 次, 每次 3min。（5）加过氧化氢封闭液室温 20 分钟，以封闭内源性过氧化氢酶，0.01 M PBS冲洗 3min。（6）滴加复合消化工作液覆盖组织表面，4 20min，0.01M PBS 冲洗
28、3 次，0.2SSC 冲洗一次(室温 3min)。（7）滴加预杂交工作液(25l/ 张) 覆盖组织，37孵育盒孵育过夜。（8）预杂交后，揭去盖玻片，以 0.2SSC 37洗 3 次,每次 5min。以上步骤所用洗液均经 DEPC 处理。（9）滴加杂交工作液(25l/ 张) 覆盖组织，37孵育盒孵育 6h。（10）揭去盖玻片以 2SSC 37洗 3 次,每次 5min；0.2SSC 37 洗 3 次,每次5min；0.l mol TBS 37洗 4 次, 每次 5 分钟。（11）滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37孵育 30 min，0.0l M PBS冲洗 3 次,每次 5min。（12）滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合工作液，37孵育 30 min，0.0l M PBS 冲洗 3 次 ,每次 5min。（13）DAB 显色，光镜下观察，当细胞浆内阳性颜色与细胞外背景色对比度反差明显时，蒸馏水洗终止反应。胞浆显棕黄色颗粒为阳性反应。80%酒精-90%酒精-无水乙醇- 二甲苯脱水,每步 4 分钟,中性树胶封片，4保存。或（13） 滴加高敏荧光链亲和素复合物（FITC）工作液，4湿盒孵育 2h。 0.01M PBS 冲洗，5min3 次。甘油封片。
