1、实验四 抗药性突变株的分离,一、目的要求 二、基本原理 三、材料方法 四、操作步骤 五、实验报告,一、目的要求,1、学习用梯度平板法分离抗药性突变株。 2、了解基因突变的特点。 3、了解诱变育种的原则和一般步骤。,基因中碱基顺序的改变可以导致微生物细胞的遗传变异。微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发突变的诱导物。,在含有一定抑制生长药物浓度的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变体就会在平板上长成菌落。经过挑取纯化，进一步进行抗性试验就可以得到所需要的抗药性菌株。,为了便于选择适当的药
2、物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。本实验采用梯度平板法分离大肠杆菌的抗链霉素突变株。,梯度平板法(抗性突变株的筛选), 生长情况,三、材料方法,1、菌株 大肠杆菌：Strs 2、培养基 LB固体培养基（底层和上层） 3、溶液或试剂 链霉素（100mg/mL） 4、仪器或其他用具 1ml无菌吸管，盛有70%乙醇的烧杯，玻璃涂棒，水浴锅等,四、操作步骤,1、接种大肠杆菌于 盛有5ml LB液体培养基的试管中，37振荡培养24h。 2、在热水浴中溶化LB琼脂培养基。 3、倒10ml 已溶化的不含药物的LB琼脂培养基于一套无菌培养皿中，立即将培养皿一端垫起，使琼脂培养基覆盖整个底部并使培养基表面
3、在垫起的一端刚好达到培养皿的底与边的交界处，让培养基在这一倾斜的位置凝固。（图）,4、在已经凝固的平板低琼脂一边标示“100”，放回水平位置后，再在底层培养基上加入含有100ug/ml链霉素的LB琼脂培养基10ml。凝固后，便制得一个链霉素浓度从一端的0ug/ml到另一端100ug/ml的梯度平板。 5、用1ml无菌吸管吸取200ul 大肠杆菌培养液加到梯度平板上，涂布。,6、37倒置培养48h。 7、选择12个在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触单个菌落朝高浓度区域划线。 8、把平板37倒置培养48h。,五、实验报告,1、图示经一次培养和经二次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况。 2、试验中第7步，是为了测试这些菌株的抗性水平，你能设计几种不同的方法来测试这些菌株的抗性水平吗？ 3、培养基中的链霉素引起了抗药突变吗？请设计一个实验加以说明。 4、梯度平板法除用于分离抗药突变株以外，还有什么其他用途？,
