1、第五讲 农杆菌介导的植物转基 因方法,植物生物技术,植物转基因方法分为两类： 一是直接基因转移方法:基因枪法、 PEG介导的原生质体法、花粉管通道法、电激转化法等，其中基因枪转化法是代表。 二是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。,基因枪法优点： 不受物种的限制 只要构建基因表达盒（启动子-基因-终止子），不需要构建在表达载体上 没有农杆菌污染 可以快速知道基因表达（瞬时表达，研究启动子功能）,缺点： 1 价格贵 2 基因往往多拷贝插入,原生质体转基因优点：不受物种的限制 只要构建基因表
2、达盒，不需要构建在表达载体上 没有农杆菌污染 可以研究基因瞬时表达缺点： 操作比较麻烦、难度大 （原生质体制备、转化、再生）,Protoplast transformation of transgenic Valencia sweet orange plants with GFP by PEG-mediation,一、农杆菌介导的（Agrobacterium-mediated ）转基因机理,土壤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性土壤杆菌，在自然界中普遍存在，其特点是能感染双子叶植物，并引起植物形成肿瘤。,天然的植物遗传工程,土壤农杆菌的基因组与Ti质粒
3、组成,原因：土壤农杆菌中Ti质粒上一段DNA（T-DNA，transfer DNA，含有细胞分裂素和生长素合成酶基因)转到了植物细胞基因组中，引起植物细胞旺盛分裂。,（一）Ti质粒的结构,毒性区,肿瘤区,冠瘿碱代谢区,复制区,Ti质粒大约在160-240kb之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和ori区（origin of replication)。,auxA auxB cyt ocs,LB,RB,LB, RB left and right borders (dir
4、ect repeat) auxA + auxB enzymes that produce auxin cyt enzyme that produces cytokinin Ocs octopine synthase, produces octopine,1.T-DNA 的结构,T-DNA上共有三套基因和左右两个边界。左边界（left border）和右边界（right border）：是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。生长素合成酶基因（tms）：由2个基因组成：tms1 （iaaM）和tms2（iaaH）；细胞分裂素合成酶基因tmr：由1个基因组成：ipt冠瘿碱合成酶
5、基因tmt：冠瘿碱是含稀有氨基酸衍生物，称为opines，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine） 、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine）。被感染的植物诱导合成这些有机碱，但植物不能利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根癌农杆菌作为氮源及碳源使用。,根据冠瘿碱不同， Ti plasmids可以为几种：,1)胭脂碱型（Nopaline plasmids）: 带有在 植物中合成胭脂碱的基因和在 细菌中代谢、利用胭脂碱的基因。形成的肿瘤可以分化出不定芽。 Nos启动子， Nos终止子。 2)章鱼碱（Octopine
6、 plasmids）:带有在 植物中合成章鱼碱的基因和在 细菌中代谢、利用章鱼碱的基因。形成的肿瘤不能分化，成为愈伤组织。,3)农杆碱型（Agropine plasmids）:带有在 植物中合成农杆碱的基因和在 细菌中代谢、利用农杆碱的基因。形成的肿瘤不分化出，然后死亡。 4) 发根型（Ri plasmids）: 诱导毛状根或者肿瘤。,2. Vir (virulent) genes（毒性基因区，致病基因区,About 30 kb; virA,B,C,D,E,F,G (A-E are operons with multiple ORFs)； 受到受伤植物细胞释放的Acetosyringone (
7、AS，乙酰丁香酮) 激活； 把Ti-质粒或者Ri-质粒的T-DNA 转移到植物细胞基因组中（转基因）。,virA - transports AS into bacterium, activates virG； virG - promotes transcription of other vir genes； virD2- endonuclease that cuts T-DNA at the borders but only on one strand; attaches to the 5 end of the SS of T-DNA； virE2- DNA-binding protein,
8、binds SS of T- DNA； virD2 & virE2 also help T-DNA get to nucleus in plant cell, they have NLSs(核定位信号)； virB - 11 ORFs, helps DNA-protein complex get through cell membranes。,（二）T-DNA的整合机制,T-DNA的详细整合机制尚不完全清楚，明确的： 农杆菌染色体上的基因（chvA, chvB, pscA等）决定与植物细胞的附着； 植物损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Ti质粒上Vir（Vi
9、rulence region)基因的表达； Vir区编码的基因产物分别在LB和RB的第三个碱基和第四个碱基之间产生缺口，形成单链T-DNA，并将其运到植物细胞核中，整合到核基因组中。由特异性内切酶完成。T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不对称的，RB顺序与整合有关，而LB无关。 T-DNA的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列。,植物肿瘤,二、植物基因表达载体,天然的Ti质粒不能作为表达载体使用： a. 被转化的植物细胞产生大量的生长素和细胞分裂素，导致肿瘤的形成，阻止了细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。 b. 冠瘿碱的合成与T-DNA的转化无关，而且
10、可能会影响植物细胞生长，因为冠瘿碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除冠瘿碱合成基因（tmt） c. Ti质粒约为200kb，重组操作非常困难，也很难找到单一的酶切位点。 d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA的大量扩增，须添加入大肠杆菌复制子。植物细胞中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。,1. 植物细胞转化的共整合系统 T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kan+。首先在E.coli中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序
11、列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上， Kan+筛选转化细胞。,共整合载体,大肠杆菌质粒,农杆菌Ti质粒,重组农杆菌Ti质粒,2. 植物细胞转化的双元系统 目前T-DNA转化植物细胞的标准方法是双元系统，即穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。,双元载体系统,目的基因表达盒,tgac
12、aggatatattggcgggtaaac RB tggcaggatatattgtggtgtaaaca LB,多克隆位点,报告基因,植物筛选基因,Kpn I,Xba I,启动子,基因,终止子,三、农杆菌介导的转基因步骤,农杆菌准备：单菌落、试管中培养，再在三角瓶中放大培养（1：30-50稀释）至OD600=0.5-1。在培养结束前1h加20-100M AS可以促进农杆菌的转化。4000-5000rpm/4离心收集，再用植物培养基悬浮，备用。 植物材料的准备：要求生长健壮、再生能力强、无菌；切成小片（小段）。 感染：将农杆菌液与植物材料混合，浸润10-30min。 共培养：植物材料在无菌吸水纸上
13、吸干农杆菌液后，转到共培养基上（共培养基常常含有AS），培养2天，转基因在此时间内完成。 筛选与再生：共培养结束后的植物材料转到选择与再生培养基上（含2种抗生素，分别抑制农杆菌和非转基因植物细胞生长）。 转基因植物的鉴定与评价：报告基因、PCR、Southern blot、Northern blot、产物分析等。,图 农杆菌转化植物细胞,感染,转化,选择,转基因植株评价与鉴定,再生,转基因植物的鉴定： （1）检测报告基因: GUS（编码葡萄糖苷酶）,报告基因检测（GUS染色）,GUS染色原理,5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷，无色,兰色,分析启动子功能,GFP: green fluorescen
14、t protein。是从维多利亚水母(Aequorea victoria)中分离出来的，受紫外线激发而发出绿色荧光,GFP基因,（2）PCR检测植物基因组中外源DNA（目的基因、启动子）,（可能有假阳性）,（3） Southern blot直接检测植物基因组中外源DNA（目的基因、启动子）,鉴定转基因最直接的证据。发表文章时必须提供该证据,基因组DNA、酶切、电泳、转移DNA到杂交膜、与探针杂交、洗脱、检测（放射法、化学法）、照相,（4）检测外源基因的转录和表达产物RT-PCR,Nortern Blot,基因表达载体的构建：目的基因和启动子的选择与获得、表达载体的构建（DNA重组）与确认。 基
15、因工程菌的获得：将基因表达载体导入农杆菌中，并选出含有基因表达载体的菌落。 建立被改良植物的高效再生体系：不定芽再生体系、胚状体再生体系、原球茎再生体系（兰花）。 确定植物材料对抗生素（潮霉素、卡那霉素）的敏感浓度：临界敏感浓度 转基因效率的提高方法：,四、怎样建立植物转基因技术,实例: 火焰卫矛（ Euonymus alata ）转基因技术研究,秋天，绿叶转红，形成霜叶红于二月花的景象,140年: 广为栽培、选育新品种；重要的园艺观赏植物，年产值2-3亿美元。 问题：结实旺盛，扩散到野外繁殖、形成优势种群，抑制本地植物生长、破坏生物多样性。 方法：禁止种植（问带来题：无替代植物，影响公司产业
16、、影响就业） 培育无籽品种：好,(1) 研究植株再生技术,不定芽的诱导最佳条件研究,生根最佳条件研究,(2) 选择抗性试验,(3) 构建 “超级不育”表达载体,pAB5启动子 花粉与胚囊特异,Barnase基因 RNA酶,Agl5启动子 子房特异,iaaM基因 合成生长素,雌雄不育,无籽结实,无籽果实,(4) 转基因植株培育,(5) 转基因植株的鉴定,转基因植株的报告基因（GUS）表达验证,X-Gluc（无色） GUS 兰色,Gusplus基因在原核生物中不表达,转基因植株的分子验证,(1) 选择抗性试验,实例2：盾叶薯蓣转基因技术,(2) 转基因植株再生,(3) 转基因植株的分子鉴定,PCR
17、扩增基因组DNA中目的基因,Southern blot分析基因组DNA中目的基因,五、影响转基因效率的因素,什么是转基因效率？ 愈伤组织水平： 转基因效率=芽的水平：转基因效率=植株水平（最重要）转基因效率=,转基因愈伤组织的总数,感染的外植体总数,X100%,转基因芽的总数,感染的外植体总数,X100%,转基因植株的总数,感染的外植体总数,X100%,一个转基因方法好不好，可以用转基因效率衡量,1.植物的再生方法与效率影响植物再生效率的因素必然影响转基因效率。植物的再生效率在转基因操作过程中会下降。2. 用于转化的植物材料类型与生理状态材料的类型（根、茎、叶片、胚轴、子叶、花器官、愈伤组织等
18、）及其生长状态（老、嫩）。月季萨蔓莎可通过叶片直接再生不定芽或通过胚性愈伤组织分化获得再生植株，小叶的植株再生率约为40 % ,但叶片转化没有得到转基因的结果。采用胚性愈伤组织进行转化时，得到GUS 基因表达的阳性结果，通过转化条件的优化，其表达率可达到70 %以上。,黄瓜子叶转基因分析: 生长时间长的子叶转基因效率高,3.农杆菌的菌株： EHA105，LBA4404，GV3101；,4.农杆菌的生长状态对数生长期的感染能力最强。O.D600=0.5-1.0 5. 共培养时间和温度时间长，有利于转化。,月季转基因,黄瓜,6. 感染时间、共培养基、光照条件和pH,7。乙酰丁香酮（AS）的浓度有些
19、双子叶植物在没有AS时也可以有很高的转化效率，但共培养基添加AS可以促进转化，特别是对于单子叶植物。最适合的AS浓度依植物而定。,黄瓜， 20uM AS,乙酰丁香酮（AS）对茶树( Camellia sinensis )、海岸松 （Pinus pinaster）转基因无效,8. 其它因素： 预培养； 无选择培养再选择培养； 抑制乙烯的形成：乙烯存在对植物的转基因有抑制作用。使用抑制剂AgNO3可以促进转基因。,读书报告题目： 1. 转基因技术在植物改良方面的应用 2. 反义RNA技术在植物上的应用； 3. RNA干扰（RNAi）技术在植物上的应用； 4.植物转基因方法的建立要求： 选择2008-2009年发表的英文研究论文（不是综述）；PPT形式；限30min/人。,
